超声波辅助提取橘皮中黄酮类化合物

党娅，耿敬章，李新生

（陕西理工学院生物科学与工程学院，陕西 汉中 723001）

柑橘（Citrus reticulata Banco）为芸香科（Rutaceae）柑橘属（Citrus）植物科属[1]，我国是柑橘原产地之一，栽培柑橘已有4000多年历史，目前我国柑橘的栽培面积居世界第一，产量居世界第三[2]。柑橘果实富含矿物质、VC、多种甙类等物质，营养价值极高[3-4]，含有丰富的香精油、黄酮类、果胶、橙皮苷等生物活性物质[5]。传统的加工方法将大部分的柑橘皮不做任何处理便丢弃掉，不仅造成了极大的资源浪费，也对环境造成了一定程度的污染。黄酮类化合物（Flavonoids）又名生物类黄酮化合物，是色原酮或色原烷的衍生物[6]，研究表明黄酮类化合物具有多种生物活性，可用于抗菌、消炎、抗突变、降压等，在抗氧化、抗癌、防癌等方面也有显著效果[7-8]。为了开发利用橘皮资源，本文就橘皮黄酮类化合物的超声辅助提取方法进行了初步的实验研究。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

柑橘采于陕西城固，取皮，60℃烘干，粉碎，以备后用。

UV-2550紫外分光光度计：日本Shimadzu公司；JBT/TCL400T/3PCD超声波药品处理机：济宁金百特有限公司；中草药粉碎面：天津市泰斯特仪器有限公司；HH-6数显恒温水浴锅：国华仪器有限公司；TDL-408系列离心机：上海安亨科技仪器厂；AL20型电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 标准曲线的绘制

芦丁的测定采用亚硝酸钠-硝酸铝分光光度法。精密称取芦丁标准品2.000 mg置于10 mL容量瓶中，加60%乙醇2.0 mL使之溶解，再加入60%乙醇定容至刻度，摇匀，即得芦丁标准溶液，每1 mL含无水芦丁0.20 mg。精密吸取芦丁标准溶液 0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL，分别置于10 mL容量瓶中，加5%亚硝酸钠溶液0.2 mL，摇匀后放置6 min，加10%硝酸铝溶液0.2 mL，摇匀后放置6 min，加氢氧化钠溶液2.0 mL，再加60%乙醇定容至刻度，摇匀，放置15 min。在最大吸收峰波长510 nm处测吸光度，以吸光度值为纵坐标，以含量为横坐标，所得数据经回归处理，得到标准曲线回归方程为y=8.375x-0.0074，相关系数为r=0.9998。

1.2.2 单因素对提取效果的影响

提取条件的研究主要考虑以下5个因素：浓度、温度、时间、料液比、超声频率。

1.2.2.1 超声频率对提取效果的影响

称取1.0000g粉碎的橘皮粉共4份，各加15mL60%乙醇，在室温下分别用低频（25.5kHz）、中频（47.6kHz）、高频（69.3 kHz）超声辅助提取20 min，并以水浴提取作为对照，提取液离心（4000 r/min）20 min，紫外测定吸光度值。

1.2.2.2 乙醇的浓度对提取效果的影响

称取1.0000 g粉碎的橘皮粉共5份，分别加入浓度为20%、40%、60%、80%、100%的乙醇溶液15 mL，在低频超声下提取 20 min，离心（4000 r/min）20 min，紫外测定吸光度值。

1.2.2.3 提取时间对提取效果的影响

称取1.0000 g粉碎的橘皮粉共6份，各加15 mL 60%乙醇，分别在低频超声条件下提取10、20、30、40、50、60 min，离心（4000 r/min）20 min，紫外测定吸光度值。

1.2.2.4 提取温度对提取效果的影响

称取1.0000 g粉碎的橘皮粉共8份，各加15 mL 60%乙醇，分别在低频超声条件下 15、25、35、45、55、65、75、85℃条件下提取20 min（乙醇的沸点是78℃），离心（4000 r/min）20 min，紫外测定吸光度值。

1.2.2.5 料液比对提取效果的影响

称取1.0000 g粉碎的橘皮粉共6份，使用60%乙醇为溶剂，分别在低频超声条件下，以 1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 g/mL 的料液比提取 20 min，离心（4000 r/min）20 min，紫外测定吸光度值。

1.2.3 正交试验确定最佳提取工艺

鉴于提取溶剂浓度、温度、时间、料液比、超声波频率对橘皮中黄酮的提取均有一定的影响，通过L16（45）正交试验确定最佳提取条件，试验水平如表1所示。

2 结果与分析

2.1 单因素对提取效果的影响

2.1.1 超声频率对提取效果的影响

不同超声频率下提取的黄酮液经离心后检测510nm处吸光度值，结果如图1所示。

表1 正交试验水平表Table1 The levels of orthogonal test

图1 超声频率对橘皮黄酮提取效果的影响Fig.1 Effect of ultrasonic frequency on extraction（510 nm）

由图1可知，超声频率在0～25.5 kHz时，黄酮提取率随超声功率逐渐增大而增高。当功率达到25.5 kHz时提取率是最高，达到0.507，此后增大频率黄酮的提取率反而缓慢下降，这可能是由于频率过大时的超声波产生的热量过多，且会降低质点之间的能量传递。

2.1.2 乙醇浓度对提取效果的影响

不同浓度的乙醇提取的黄酮液均经离心检测510nm处吸光度值，结果如图2所示。

图2 乙醇浓度对提取效果的影响（510 nm）Fig.2 Effect of concentration on extraction（510 nm）

由图2可知，乙醇浓度在40%以下时，提取率比较低，而且变化缓慢，浓度在40%～60%之间时，提取率明显提高；浓度超过60%提取率反而会下降，浓度在80%以后提取率基本处于平缓状态。这是因为当乙醇浓度增加时，某些溶质溶出也增多，因而会降低黄酮的提取率，而且还会给提纯带来困难。因此，用乙醇作溶剂时，浓度应以60%最为适合。

2.1.3 提取时间对提取效果的影响

提取不同时间的黄酮液均离心后检测510 nm处吸光度值，结果如图3所示。

图3 提取时间对橘皮黄酮提取效果的影响（510 nm）Fig.3 Effect of time on extraction（510 nm）

由图3可知，10 min～20 min内橘皮黄酮提取率随着超声时间的增加而急剧增加，随之黄酮的提取率随时间的延长而增加缓慢。这是因为，刚开始黄酮溶出率比较低，溶液中的黄酮含量少，因此随着时间的延长可以提高黄酮的提取速率。随着橘皮中大部分的黄酮已被提取出，此时再延长时间则溶出速率缓慢，且逐渐达到平衡。

2.1.4 提取温度对提取效果的影响

不同温度下提取的黄酮液均离心后检测510 nm处吸光度值，结果如图4所示。

图4 提取温度对提取效果的影响（510 nm）Fig.4 Effect of temperature on extraction（510 nm）

由图4可知，温度在15℃到25℃时，提取率与提取温度成正比，而85℃时有所回落，其原因可能是较高的温度一方面会使提取出的黄酮分解，一方面导致乙醇溶剂的挥发，从而降低了提取效果。

2.1.5 料液比对提取效果的影响

不同料液比提取的黄酮液均稀离心后检测510 nm处吸光度值，结果如图5所示。

图5 料液比对提取效果的影响（510 nm）Fig.5 Effect of material ratio and solvent on extraction（510 nm）

由图5可知，黄酮提取液的吸光度值随料液比的增大而降低，其原因可能是：在橘皮粉与提取溶剂可以充分混溶的条件下，过量的溶剂的稀释效果大于它对黄酮的提取效果。

2.2 最佳提取工艺的确定

按表1所示的试验水平进行L16（45）正交试验，结果如表2所示。

表2 正交试验结果Table 2 The results of orthogonal test

由表2可知，影响橘皮黄酮提取效果的因素的主次顺序为E>D>C>B>A，即料液比>乙醇浓度>提取温度>提取时间>超声频率，其最优组合为A2B4C4D2E1，做验证性试验，测得由该组条件所得的黄酮液的吸光度值为0.914，符合上述结论。因此可确定超声波辅助提取橘皮黄酮的最佳提取工艺条件：超声波频率为低频（25.5 kHz），提取溶剂为60%乙醇，提取时间为40 min，提取温度为 75 ℃，料液比为 1∶10（g/mL）。

3 结论

超声辅助法从橘皮中提取黄酮类成分的工艺成本低，提取效果好，因此有相当广阔的应用前景。试验结果表明，仅从单因素考虑：低频超声波（25.5 kHz）的提取效果较好，60%乙醇的提取效果较好，提取效果与提取时间成正比，75℃的提取效果较好，通过L16（45）正交试验综合分析，得出该橘皮黄酮的最佳提取工艺：超声波频率为低频（25.5 kHz），提取溶剂为60%乙醇，提取时间40min，提取温度75℃，料液比1∶10（g/mL）。

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