比色法测定不同产地黑豆皮中花青素含量

张泽生，林纪伟，2，王志平，於洪建，刘岱琳

（1.天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457；2.中国人民武装警察部队医学院生药教研室，天津 300162；3.郑州人民医院药剂科，河南 郑州 450012；4.天津市尖峰天然产物研究开发有限公司，天津 300457）

黑豆是我国一种传统种植的农作物，其具有悠久的食用和药用历史，自古以来民间就有用黑大豆补血、活血和乌发养颜的记载。黑豆皮，又称乌衣，富含大量花青素,主要以飞燕草素、矢车菊素为主[1]，具有抗氧化活性[2]、抑制诱变[3-4]、抗炎[5]、预防癌症以及延缓衰老等多种保健功效[6]，一直是天然食用添加剂和健康保健食品的原料。

我国是农业大国，从南到北很多省份都种植黑豆，资源丰富，可谓世界各国之首[6]。在我国的北方，如天津市、河北省、山东省都有丰富的黑豆产量，但是由于产地不同，黑豆皮中的功效成分差异较大，因此本文在文献工作基础上，利用比色法测定不同产地黑豆皮中花青素的含量，从而进一步控制黑豆皮的质量，为其在食品添加剂和保健食品中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器设备

1.1.1 材料

黑豆皮原料：黄仁黑豆皮，产自湖北；青仁黑豆皮，产至东北，青扁黑豆皮，产自安徽；市售黑豆皮，产自山东滨州；内蒙黑豆皮，产自内蒙古。所有试验黑豆皮原料由天津市尖峰天然产物研究开发有限公司提供。

1.1.2 试剂

飞燕草素标准品：挪威Polyphenols公司；无水乙醇、甲醇：均为分析纯，天津康科德化工有限公司；盐酸：天津大茂化工有限公司。

1.1.3 仪器设备

UV-2401PC：日本岛津公司；HZQ-QX型电动振荡机：东联电子技术开发有限公司。

1.2 方法

1.2.1 检测波长的确定

用1%盐酸甲醇溶液配制少量黑豆皮提取液，用UV-2401PC紫外可见分光光度计200 nm～600 nm的范围内对色素进行扫描，得黑豆皮提取液的吸附光谱图。同时对标准品溶液在200 nm～600 nm的范围内进行扫描，得到飞燕草素标准品溶液的吸附光谱图。

1.2.2 标准曲线的测定

1.2.2.1 标准溶液的配制

精密称取飞燕草素对照品适量，用1%盐酸甲醇溶液溶解，定容在100 mL容量瓶中，配制成85.211μg/mL的标准品储备液，备用。

1.2.2.2 标准曲线的测定

分别精密吸取 2、4、6、8、10 mL 标准品储备液转移至100 mL容量瓶中，用1%盐酸甲醇溶液稀释并且定容至刻度。在520 nm下测定吸光度，测定标准曲线。

1.2.3 黑豆皮提取物样品溶液的配制

准确称取黑豆皮原料5 g加入浸提液浸泡过夜，过滤，测定其体积为V。精密吸取1 mL样品浸提液，置1000 mL棕色容量瓶中，用1%的盐酸甲醇定容到刻度，以同批1%盐酸甲醇溶液作空白，置520 nm处测定其吸收度。花青素含量利用1.2.2.2中的标准曲线进行测定。

1.2.4 黑豆皮中花青素提取条件优化

1.2.4.1 提取溶剂的选择

准确称取黑豆皮5 g，共4份，分别置于100 mL三角瓶中，分别加入甲醇、95%乙醇，1%盐酸甲醇50 mL和1%盐酸乙醇各50 mL，浸提8 h。按照1.2.3项下配制方法进行样品制备，测量其吸光度。通过对甲醇、95%乙醇、含有体积比例为1%盐酸的甲醇溶液和95%乙醇溶液进行考察，确定最佳提取溶剂。

1.2.4.2 提取溶液盐酸用量的选择

准确称取黑豆皮5 g，共5份，分别置于100 mL三角瓶中。分别加入甲醇50 mL、0.5%盐酸甲醇溶液（体积分数）50 mL、1%盐酸甲醇溶液（体积分数）50 mL、1.5%盐酸甲醇溶液（体积分数）50 mL、2%盐酸甲醇溶液（体积分数）50 mL，浸提8 h。按照1.2.3项下配制方法进行样品制备测量其吸光度。

1.2.4.3 提取时间的选择

准确称取黑豆皮5 g，共6份，分别置于100 mL三角瓶中，精密加入1%盐酸甲醇50 mL。6份样品，密封状态下进行提取，提取时间分别为 1、2、4、6、8、10 h。然后按照1.2.3项下配制方法进行样品制备，测量其吸光度。

1.2.4.4 料液比的选择

准确称取黑豆皮5 g，共5份，分别置于100 mL三角瓶中。分别加入 1%盐酸甲醇 10、25、50、75、100 mL。密闭状态下进行浸提8 h。然后按照1.2.3项下配制方法进行样品制备，测量其吸光度。

1.2.5 加样回收率的测定

精密称取已知含量的供试品原料5 g，准确加入与供试品中花青素含量相同的飞燕草素对照品，按照1.2.4中确定的提取方法进行提取，按1.2.3项下确定的方法准确测定，计算平均回收率。

1.3 样品的含量测定

分别准确称取不同产地的黑豆皮5 g，按照1.2项下确定的最优提取方法进行提取，按照1.2项下的含量测定方法进行含量测定。每个产地的黑豆皮平行测定3次。

2 试验结果

2.1 检测波长的确定

图1a是黑豆皮提取物在1%盐酸甲醇溶液中的吸收光谱，从光谱中可以看出黑豆皮提取物分别在520、362、279、205 nm 处有吸收峰，而 520 nm 为花青素类色素的特征吸收峰。图1b是标准品飞燕草素在1%盐酸甲醇溶液中的吸收光谱，从光谱中可以发现其在520、360、280 nm处有吸收峰，综合分析后，选择520 nm作为黑豆皮提取物中花青素吸收度的检测波长。

2.2 标准曲线的测定及方法学考察

2.2.1 标准曲线的测定

按照1.2.2.2项下方法进行测定，结果如图2所示。

图1 黑豆皮提取物和标准品的紫外吸收图谱Fig.1 The UV spectrum of Black Soya Bean Extract and delphinidin

图2 标准曲线的测定Fig.2 Detection of linear curve

标准曲线为A=0.0943x，（x表示为测试溶液的浓度，单位为 μg/mL），r=0.9996（n＝5），该标准曲线在浓度为1.7μg/mL～8.5μg/mL的范围内线性良好。

2.2.2 精密度的测定

吸取标准品溶液1 mL，按1.2.2.2项下的方法进行精密度测定，RSD=0.21%（n=6），本方法的精密度良好。

2.2.3 稳定性的测定

吸取供试品溶液 1 mL，分别在 2、4、6、8、10 h 后测定吸光度值。试验结果表明：在0～10 h内稳定性良好，RSD=0.23%。

2.2.4 重现性试验

准确称取同一产地的黑豆皮5份，每份5 g。按1.2.4项下确定的方法进行提取，再按1.2.3项下方法进测定，实验结果显示，该方法重现性良好，RSD为0.74%（n=5）。

2.3 黑豆皮中花青素提取条件优化

2.3.1 提取溶剂的选择

不同溶剂的浸提结果见表1。

表1 不同溶剂的浸提结果Table 1 Extraction using different solution

表1测试结果显示采用1%的盐酸甲醇溶液作为提取溶剂时，吸光度最高，说明具有很好的提取效果。因此本试验采用1%的盐酸甲醇作为提取溶剂。

2.3.2 提取溶剂酸度选择

不同盐酸浓度的浸提结果见表2。

表2 不同盐酸浓度的浸提结果Table 2 Extraction using different content HCl

测试结果如表2，在相同提取时间条件下，随着盐酸浓度的增加，测试溶液的吸光度值也在增高。说明酸度的增加会提高提取收率。但是从1%～2.5%的酸度变化，提取溶液的吸光度值增加并不明显，因此确定提取溶液盐酸浓度为1%。

2.3.3 提取时间的选择

不同时间的浸提结果见表3。

表3 不同时间的浸提结果Table 3 Extraction using different time

如表3所示，浸提时间达到8 h时，吸光度值达到最高，而且随着提取时间的增加，吸光度值达到稳定。因而确定浸提时间为8 h。

2.3.4 料液比的选择

不同料液比的浸提结果见表4。

表4 不同料液比的浸提结果Table 4 Extraction using different volume solution

通过对不同料液比的考察，结果如表4所示，料液比为1∶10时，吸光度值达到最高，因而确定最佳料液比为 1∶10。

2.4 加样回收率的测定

按照1.2.5项下确定的方法准确测定，平均回收率为 98.34%，RSD=2.32%（n=5）。

2.5 不同产地黑豆皮中花青素的含量

按照1.2.4项下确定的提取方法进行含量测定，结果如表5所示。分析结果如表5所示，市售的黑豆皮其花青素含量相对较低，而安徽产的青扁黑豆皮花青素含量相对较高。

表5 不同产地黑豆皮中花青素的含量测定Table 5 Detection of anthocyanidin of black soybean from different varied area

3 小结与结论

1）对国内不同产地的黑豆皮原料进行了花青素含量测定，测试结果显示不同产地的黑豆皮原料中花青素的含量差异较大，品种之间以安徽产的青扁黑豆皮花青素含量相对较高，虽然市售黑豆皮的含量相对较低。

2）本文利用紫外分光光度法测定不同区域的黑豆皮中花青素的含量，该方法简便，快速，结果准确，可靠，适于黑豆皮中花青素成分的质量控制。

[1]JINHL,KANGNS,SHINSO,et al.Characterisation of anthocyanins in the black soybean (Glycine max L.)by HPLC-DAD-ESI/MS analysis[J].Food Chemistry,2009,112:226-231

[2]ASTADI I R,ASTUTI M,SANTOSO U,et al.In vitro antioxidant activity of anthocyanins of black soybean seed coat in human low density lipoprotein(LDL)[J].Food chemistry,2009,112:659-663

[3]WANG Yen-ju,SHEEN Leen-yan,CHOU Cheng-chun,et al.Storage effects on the content of anthocyanin,mutagenicity and antimu-tagenicity of black soybean koji[J].LWT-Food science and technology,2010,43:702-707

[4]HUANG Yu-hsiang,HUANG Hui-yu,CHOU Cheng-chun,et al.Mutagenic and antimutagenic effects of methanol extracts of unfermented and fermented black soybeans[J].International journal of food microbiology,2007,118:62-68

[5]Nizamutdinwa I T,Kim Y M,Chung I,et al.Anthocyanins from black soybean seed coats stimulate wound healing in fibroblasts and keratinocytes and prevent inflammation in endothelial cells[J].Food and chemical toxicology,2009,47:2806-2812

[6]李莹,张亮,刘志玲,等.黑豆种植与加工利用[M].北京:金盾出版社,2006:5-8