甘草多糖提取纯化工艺研究

王振强，申森，樊欣

（1.黄河水利职业技术学院，河南 开封 475003；2.开封第一人民医院，河南 开封 475001）

甘草（Glycyrrhiza）属多年生草本植物，主要产于新疆、内蒙、山西、甘肃、陕西等地，常用中草药，有中草药之王的美誉，是我国传统的“药食兼用”中药材料。近年随着人们对甘草多糖认识的提高，人们发现多糖参与了细胞的多种生命现象的调节，如免疫细胞间信息的传递和感受，具有多种保健功能，在医药、食品、工业等方面得到广泛应用。因此，开展甘草多糖提取工艺研究具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料

甘草：市售；甲醇、无水乙醇、苯酚（以上均为分析纯）：天津北方天医化学试剂厂；硫酸（分析纯）：文达稀贵试剂化工厂；甲醇（色谱纯）天津大学科威公司。

1.2 仪器与设备

YP型电子天平：上海天平仪器厂；LSY电热恒温水浴锅：北京医疗设备厂；DG404真空电热干燥箱：天津市天宇实验仪器有限公司；LG16-W离心机：北京医用离心机厂；QL-901微型漩涡混合器：其林贝尔仪器制造公司。

1.3 方法

1.3.1 甘草多糖测定方法

采用苯酚-硫酸比色法测定甘草多糖。

1.3.2 测定原理

多糖被浓硫酸在适当高温下水解，产生单糖，并迅速脱水成糠醛衍生物，在强酸条件下与苯酚起显色反应，生成橙黄色物质，在波长490 nm处其吸光度A值与糖浓度C呈线性关系，从而可用比色法测定其含量。

1.3.3 标准溶液的配制

称取干燥的葡萄糖20.00 mg，置500 mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度线，摇匀，配得葡萄糖标准溶液。

1.3.4 苯酚溶液的配制

称取80.0 g苯酚加20.0 g水使之溶解，配制80%苯酚溶液，置于冰箱中避光保存。然后取80%苯酚37.5 mL定容到500 mL，配制成6%的苯酚溶液避光保存备用。

1.3.5 单因素对甘草多糖提取的影响

1.3.5.1 料液比影响

称取5份甘草粉末各1.0 g，置于250 mL圆底烧瓶中，分别加入 15、20、25、30、35 倍水，100 ℃水浴下，回流提取 1 h，离心分离（5000 r/min，15min），浸提液至100 mL容量瓶蒸馏水定容，取2 mL于10 mL试管中用硫酸-苯酚法测定其吸光度值。

1.3.5.2 提取温度影响

称取5份甘草粉末各1.0 g，置于250 mL圆底烧瓶中，各加入 15 倍水，分别在 40、50、60、70、80、90、100 ℃水浴下，回流提取 1 h，离心分离（5000 r/min，15 min），浸提液至100 mL容量瓶蒸馏水定容，取2 mL于10 mL试管中用硫酸-苯酚法测其吸光度值。

1.3.5.3 提取时间影响

称取5份甘草粉末各1.0 g，置于250 mL圆底烧瓶中，各加入15倍水，70℃水浴下，分别回流提取0.5、1、1.5、2、2.5、3 h，离心分离（5000 r/min，15 min)，浸提液至100 mL容量瓶蒸馏水定容，取2 mL于10 mL试管中用硫酸-苯酚法测其吸光度值。

1.3.5.4 提取次数影响

称取5份甘草粉末各1.0 g，置于250 mL圆底烧瓶中，各加入15倍水，70℃水浴下，分别回流提取1、2、3、4、5、6、7、8 次，每次提取 0.5 h，离心分离（5000 r/min，15 min），浸提液至100 mL容量瓶蒸馏水定容，取2 mL于10 mL试管中用硫酸-苯酚法测其吸光度值。

1.3.6 提取工艺正交试验因素水平选择

根据单因素试验结果，设计正交试验，确定最佳提取工艺条件见表1。

表1 提取工艺正交试验因素水平表Table 1 Orthogonal experiment factor level glass

1.3.7 醇沉条件正交试验因素水平选择

取粉碎甘草约25 g，按照最优提取条件进行提取，并设计正交试验见表2。

1.3.8 多糖提取率测定

按照最佳提取工艺进行提取，然后再用醇沉最佳条件进行纯化，得出甘草多糖的提取率。

表2 醇沉条件正交试验因素水平表Table 2 Orthogonal experiment factor level glass

2 结果与分析

2.1 单因素对甘草多糖提取的影响

2.1.1 料液比影响

取粉碎样品，提取条件为100℃、1 h、提取次数1 次，料液比分别为 1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 g/g。料液比对甘草多糖提取效果的影响如图1所示。

图1 料液比影响Fig.1 Liquid ratio influence

由图1可以看出，甘草多糖提取量随料液比的增大而增加。当料液比大于1∶30 g/g时，甘草多糖提取量缓慢降低。

2.1.2 温度影响

取粉碎样品，提取条件为料液比1∶15 g/g、提取时间 1 h、提取次数 1 次，温度分别为 40、50、60、70、80、90、100℃。提取温度对甘草多糖提取效果的影响如图2所示。

图2 提取温度影响Fig 2 Extraction temperature influence

由图2可以看出，提取温度由40℃增加到70℃时，甘草多糖提取量随温度的提高而上升，当温度超过70℃以后，继续提高温度，甘草多糖的提取量缓慢下降。

2.1.3 提取时间影响

取粉碎样品，提取条件为料液比1∶15g/g、温度70℃、提取次数为 1 次，提取时间分别为 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5h。提取时间对甘草多糖提取效果的影响如图3所示。

由图3可以看出，在提取时间1 h时提取率较高，随着时间的延长，提取率下降。

图3 提取时间影响Fig 3 Extraction time influence

2.1.4 提取次数影响

取粉碎样品，提取条件为料液比1∶15g/g、温度70℃，提取时间为 0.5 h、提取次数分别为 1、2、3、4、5、6、7、8次。提取次数对甘草多糖提取效果的影响如图4所示。

图4 提取次数影响Fig 4 Extraction times influence

由图4可以看出，随着提取次数的增加，提取率不断提高，当增加到6次后，提取率缓慢下降。

2.2 甘草多糖提取条件的正交优化试验结果

甘草多糖提取条件正交优化试验结果见表3，方差分析结果见表4。

由表3可知，单因素对提取效果的影响顺序为：A>B>C>D，由表4可知，A因素具有显著性（P<0.05）影响，B、C具有较显著性（P<0.1）影响，由于D没有显著性影响，选取较为节约的条件，提取次数2次，结合甘草多糖提取正交试验分析结果，甘草多糖提取最佳工艺条件为 A4B1C2D4，即温度 90 ℃，料液比 1∶30 g/g，时间0.5 h，提取次数2次。按最佳条件进行验证，甘草多糖提取率为59.80%。

2.3 醇沉条件正交试验结果

醇沉条件正交优化试验结果见表5，方差分析结果见表6。

由表5可知，单因素对醇沉条件的影响顺序为：A>B>C，由表6可知，A因素具有显著性（P<0.05）影响，B、C具有较显著性（P<0.1）影响，结合醇沉条件正交试验分析结果，最佳醇沉条件为A1B1C3，即乙醇浓度80%，絮凝时间12 h，室温下醇沉。

表3 甘草多糖提取条件正交试验设计Table 3 Orthogonal experiment design of Glycyrrhiza polysaccharide extraction condition

表4 正交试验方差分析结果Table 4 Orthogonal experiment variance analysis result

表5 醇沉条件正交试验设计Table 5 Orthogonal experiment design of alcohol precipitation

表6 正交试验方差分析结果Table 6 Orthogonal experiment variance analysis result

3 结论

1）根据甘草多糖提取正交试验及方差分析结果，单因素对提取效果的影响顺序为：温度>料液比>提取时间>提取次数，其中温度具有显著性，料液比和提取时间较显著，提取次数不显著；甘草多糖提取最佳工艺条件为 A4B1C2D4，即温度 90 ℃，料液比 1∶30 g/g，时间0.5 h，提取次数2次。按最佳条件进行验证，甘草多糖提取率为59.80%。

2）根据醇沉条件正交试验及方差分析结果，单因素对醇沉条件的影响顺序为：乙醇浓度>絮凝时间>醇沉温度，其中乙醇浓度具有显著性，絮凝时间和醇沉温度较显著，最佳醇沉条件为A1B1C3，即乙醇浓度80%，絮凝时间12 h，室温下醇沉。

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