部分纯化的牛心细胞质提取物对心肌细胞膜“run-down”L-型钙通道活性的恢复作用

赵金生，赵妍，2，赵美眯，刘书源，侯平，郝丽英

（1.中国医科大学药学院药物毒理学教研室，沈阳110001；2.中国医科大学药学院药剂学教研室，沈阳110001；3.辽宁中医药大学附属医院心血管内科，沈阳110032）

心肌细胞中的L-型钙通道 （L-type Ca2+channel）对心脏具有重要意义。细胞外的Ca2+通过L-型钙通道内流，激活肌浆网上的雷尼丁受体（ryanodine receptor，RYR）使肌浆网内储存的Ca2+释放进入胞质，进而使细胞内的Ca2+浓度增高，称为“钙触发钙释放”（Ca2+-induced Ca2+release，CICR）。该过程在心脏的兴奋-收缩耦联（excitation-contraction，EC）中起关键性作用。L-型钙通道与某些心血管疾病的发生及治疗密切相关，包括冠心病、高血压、心律失常等常见的心血管系统疾病。

采用膜片钳制技术对L-型钙通道进行电生理研究发现，以细胞贴附记录模式和膜内向外记录模式测定L-型钙通道活性时，当用人工生理溶液代替细胞内液时L-型钙通道的活性显著降低［1］，这种现象被称为钙通道的“run-down”现象，由此推测细胞内存在维持L-型钙通道基本活性的物质［2］。钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ（calcium/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ，CaMKⅡ）是机体内一种重要的蛋白激酶，广泛参与机体多种生理活动和病理变化的信号转导过程，在维持细胞内Ca2+稳态方面发挥着重要的调节作用［3～5］。有研究表明，CaMKⅡ通过与L-型钙通道的IQ区域结合使其磷酸化，进而使离子通道开放频率增加，钙电流增加［6］，同时通过易化调节扩大L-型钙通道对Ca2+依赖性信号通路的反应［7，8］。牛心肌细胞质粗提取物可以逆转“rundown”L-型钙通道的活性［2］，本研究观察牛心细胞质部分纯化提取物对“run-down”L-型钙通道活性的恢复作用，并探讨此作用是否与CaMKⅡ相关。

1 材料与方法

1.1 材料

健康Wistar大鼠（中国医科大学实验动物中心提供）；DEAE sephadex A50离子交换树脂（Pharmacia公司）；Protease（Sigma公司）；胶原酶Ⅰ型（Worthington biochemical公司）；CaMKⅡ抗体（Santa Cruz公司）；山羊抗小鼠二抗 （北京中杉试剂公司）；IX71倒置显微镜（Olympus公司）；P-97微电极拉制仪 （Sutter Instrument公司）；200B膜片钳放大器（Axon公司）；MPC-325-2微操作器（Sutter Instrument公司）；1440A数模转换器 （Axon公司）；PowerpacTMBasic型凝胶电泳仪（Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 牛心细胞质部分纯化提取物的制备：取新鲜牛心的左心室组织约100 g，在冰浴中用剪刀剪成约1 cm3的小块；加入预冷的生理盐水200 mL，进一步剪碎，4℃、500g离心10 min，重复2次，洗去血液；将组织块置于组织匀浆机中，加入预冷的蛋白裂解缓冲液300 mL进行组织匀浆，10 s×3次；匀浆液超声提取蛋白，10 s×5次，尽量避免产生气泡，冰浴中放置30 min后；4℃10000g离心20 min，取上清；4℃100000g离心30 min，取上清；用0.45 μm，微孔滤膜过滤。在滤液中加入预处理过的 DEAE-sephadex A50离子交换树脂，冰浴中放置30 min进行离子交换；抽滤，保留树脂，弃去滤液；将树脂用180 mmol/L的KCl溶液60 mL分3次洗脱，保留树脂，弃去滤液；将树脂用360 mmol/L的KCl溶液60 mL分3次洗脱，弃去树脂，保留滤液，即得牛心细胞质部分纯化提取物。采用IO液进行透析，并用Bradford法测定蛋白浓度，实验中调整为所用的浓度，即1mg/mL。

1.2.2 Western blot检测牛心细胞质部分纯化提取物中CaMKⅡ的表达：取细胞质溶液和细胞质部分纯化提取物，以Brodford法测定样品中蛋白含量，等量蛋白样品经SDS-PAGE凝胶电泳分离，转印，加入CaMKⅡ一抗反应，加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，洗膜后按ECL说明书操作，发光检测CaMKⅡ蛋白。

1.2.3 CaMKⅡ的制备：将大鼠CaMKⅡα的cDNA模板进行PCR扩增后插入谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferase，GST） 融 合 蛋 白 表 达 质 粒pGEX-6p-1 （GE healthcare biosciences，piscataway，NJ，USA）后，将质粒转染入大肠埃希杆菌BL21（DE3）。用GST融合蛋白纯化试剂盒（GE healthcare biosciences）制备和纯化CaMKⅡ的GST融合蛋白。GST融合蛋白位点用 PreScissionTM蛋白酶（GE healthcare biosciences）在IO液中进行酶切，获得CaMKⅡ蛋白。采用Bradford方法进行蛋白定量，实验中调整为所用的浓度，即0.7 μmol/L。

1.2.4 大鼠心室肌细胞的制备：大鼠250～350 g，雌雄不限，1%戊巴比妥钠110 mg/kg腹腔注射麻醉，在人工呼吸机支持下主动脉插管。游离出心脏后置于Langendorff灌流装置，进行主动脉逆行灌流。先用台氏液灌流约3 min，继以无钙台氏液灌流约6 min，然后用含胶原酶（0.22 mg/mL）的无钙台氏液消化20～30 min，最后用保存液冲洗残酶约5 min。整个灌流系统用恒温水浴保持在37℃，所有液体均用纯氧饱和。灌流结束后，取下心脏，放入室温的KB液中机械分离细胞，得到单个细胞悬液。经105 μm的钢丝膜滤过后，加入蛋白酶于37℃水浴均匀震荡4 min，用保存液清洗3次，800 r/min×3 min离心，以去除残留酶，弃去上清后将分离的细胞置于4℃冰箱稳定1 h后进行实验。

1.2.5 单通道L型钙电流的记录：应用膜片钳放大器，利用细胞贴附式和膜内向外式膜片钳制技术记录细胞膜钙通道单通道电流。利用Ba2+负载记录细胞膜上L-型钙通道电流，通过L-型钙通道的钡电流由-70 mV至0 mV的去极化脉冲引出，波宽200 ms，刺激频率0.5 Hz，数据经由膜片钳放大器记录后以3.3 Hz的采集速率输入计算机，减去漏电流。用pClamp10.0软件记录数据并以pClamp10.0分析软件和自编的单通道分析软件进行分析。通道活性以通道开放频率NPo表示。测定实验脉冲开始后5～105 ms期间的平均电流（I），并除以单通道电流幅值（i），根据 I=N×Po×i，获得通道开放频率 NPo。其中N为膜片中的通道数目，Po为单一通道的开放频率，i为单通道电流。

在细胞贴附模式下记录钙通道电流2 min，计算此时的通道开放概率NPo。然后通过缓慢抬高记录电极的方法，将电极上的膜片从细胞膜上游离下来，形成膜内向外的膜片记录方式。以基本细胞内液灌流膜片，诱导钙通道的“run-down”现象1 min后，将膜片移入含有3 mmol/L ATP和含有不同蛋白成分的小灌流槽中。观察L-型钙通道电流变化，计算此时的NPo，与细胞贴附式下的NPo相比，算出相对开放概率百分数，以此代表钙通道活性的变化。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 部分纯化的牛心细胞质提取物对“run-down”L-型钙通道活性的恢复作用

首先通过细胞贴附模式记录大鼠心肌细胞膜上的L-型钙通道的基本活性，随后采用膜内向外的记录模式将膜片移至细胞内液中。如图1A所示，L-型钙通道的活性迅速降低，即出现“run-down”现象，此时L-型钙通道的活性与细胞贴附记录模式相比降低至（0.46±0.15）%。如图1B 所示，在3 mmol/L的ATP存在下，牛心肌细胞质提取物使L-型钙通道的活性恢复至细胞贴附模式的（44.29±13.51）%，与“run-down”电流相比差异有统计学意义（P<0.01）。加入 CaMKⅡ抑制剂 KN-62（1 μmol/L）后，L-型钙通道的活性恢复仅为细胞贴附模式记录的（1.30±0.94）%，与未加入KN-62组相比差异有统计学意义（P<0.05），如图1C所示。实验结果表明，牛心肌细胞质提取物对“run-down”L-型钙通道活性有恢复作用，此作用可能与CaMKⅡ有关。

2.2 Western blot方法检测心肌细胞质提取物中CaMKⅡ

根据2.1实验结果，将牛心肌组织细胞质提取物和用离子交换方法进行纯化得到的部分纯化提取物采用Western blot方法检测CaMKⅡ蛋白。实验结果表明，细胞质提取物和部分纯化提取物中均含有CaMKⅡ，结果如图2所示。进一步说明牛心肌细胞质提取物及部分纯化物对“run-down”L-型钙通道活性的恢复与CaMKⅡ有关。

2.3 CaMKⅡ对“run-down”L-型钙通道的调节

采用膜片钳制技术膜内向外记录模式测定融合蛋白法制备的CaMKⅡ对“run-down”L-型钙通道活性的恢复作用。实验结果表明，CaMKⅡ将L-型钙通道活性恢复至细胞贴附记录模式的（71.59±14.76）%，与“run-down”电流相比差异有统计学意义（P<0.01）。结果如图3所示。直接证明了CaMKⅡ对“rundown”L-型钙通道活性具有恢复作用。不同成分对“run-down”L-型钙通道活性的恢复结果如图4所示，细胞质部分纯化提取物和CaMKⅡ对“run-down”L-型钙通道活性的恢复与“run-down”组相比均差异有统计学意义。

3 讨论

L-型钙通道是心肌细胞中的膜通道蛋白，在心肌的兴奋-收缩耦联过程中发挥着重要的信号调节作用，具有重要的生理和病理学意义。L-型钙通道可通过细胞内PKA、PKG和PKC等多种第二信使通路进行调节［9］。在心肌细胞中，CaMKⅡ调节着使Ca2+保持稳态的多种下游靶蛋白，而最近的研究结果表明，CaMKⅡ在调节L-型钙通道活性方面也发挥着非常重要的作用和意义［10，11］。

本课题组的前期研究工作已经证明，牛心肌细胞质提取物对“run-down”L-型钙通道活性具有恢复作用，本实验希望进一步研究提取物中的哪些成分对“run-down”L-型钙通道的活性具有恢复作用。将牛心肌细胞质提取物采用离子交换树脂进一步纯化，收集不同的洗脱部分，采用膜片钳单通道技术记录L-型钙电流，测定不同洗脱部分对“run-down”L-型钙电流的恢复作用。实验结果表明，180～360 mmol/L KCl的洗脱部分对“run-down”L-型钙通道活性具有恢复作用，表明该部分纯化物中某些细胞因子具有维持L-型钙通道基本活性的作用。在该部分纯化物中加入CaMKⅡ抑制剂KN-62，并测定其对“run-down”L-型钙电流的恢复作用，结果表明其恢复“run-down”L-型钙通道活性的作用被阻断，推测提取物中的CaMKⅡ对恢复“run-down”L-型钙通道的活性具有重要作用。进一步采用Western blot方法检测牛心肌细胞质部分纯化提取物中的CaMKⅡ，结果表明其中含有CaMKⅡ蛋白。有研究表明，L-型钙通道在胞质侧存在CaMKⅡ的磷酸化位点［3］。实验中进一步采用融合蛋白的方法制备得到CaMKⅡ，并将CaMKⅡ进行细胞贴附记录模式和膜内向外记录模式的膜片钳制实验，以进一步证明CaMKⅡ对“run-down”L-型钙通道活性的恢复作用。实验结果表明，CaMKⅡ可以使“run-down”L-型钙通道的基本活性恢复至细胞贴附记录模式的（71.59±14.76）%，说明CaMKⅡ具有维持心肌细胞L-型钙通道基本活性的作用。

综上所述，牛心细胞质部分纯化提取物对大鼠心肌细胞膜“run-down”L-型钙通道的活性具有恢复作用，该作用与CaMKⅡ蛋白密切相关，CaMKⅡ对于维持细胞内Ca2+浓度的稳态具有重要意义。

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