不同剂量食用白酒对大鼠心脏功能和血管紧张素II的影响*

2012-12-03 07:30刘爱东陈远寿潘贵书
遵义医科大学学报 2012年2期
关键词:灌胃低剂量左心室

蒋 慧,刘爱东,王 晖,陈远寿,潘贵书

(1.遵义医学院 09级生理学硕士研究生;2.遵义医学院生理学教研室,3.遵义医学院 07级生理学硕士研究生,贵州 遵义 563099)

酒精性心肌病(Acoholic Crdiomypathy,ACM)是因乙醇及其主要代谢产物乙醛对心脏直接或间接的损害造成的心肌紊乱,是一种特殊类型的扩张型心肌病,其病理改变表现为心肌细胞及间质水肿和纤维化,线粒体变性等[1]。其中肾素-血管紧张素系统(Renin-Angiotensin System,RAS)在ACM的发生和发展中发挥着重要作用。血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)是RAS的主要作用因子。AngⅡ通过与其特异的受体结合发挥多种生物学效应[2,3]。病理状态激活的 RAS可以引起高血压、心肌肥厚、心力衰竭、血管疾病等[3]。本研究旨在探讨不同剂量下食用白酒给予SD大鼠灌胃一定时间后,观察大鼠收缩压、左心室内压、血浆AngⅡ的浓度及心肌血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1)的表达。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 市售遵义某酒厂生产的53°食用白酒,AngⅡ放射免疫试剂盒(北京生物技术研究所),RT-PCR所需试剂(大连宝生物工程有限公司)。

1.2 主要仪器 BL-420S生物实验系统(成都泰盟科技有限公司),Eppendorf M aster-cycler Gradient(Eppendorf,德国),iCycler iQ real- time PCR仪(BIO-RAD,美国)。

1.3 实验动物及分组 24只清洁级雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,体重(200±20)g,由第三军医大学野战外科研究所动物室提供(许可证号:SCXK-(渝)2002008)。大鼠适应性喂养1周后,用简单随机抽样方法随机分为低剂量组、高剂量组和正常对照组。低剂量和高剂量分别给予4 mL·kg-1·d-1、8 mL·kg-1·d-1的 53°食用白酒灌胃,对照组给予等体积量生理盐水(4 mL·kg-1·d-1)灌胃。每天灌胃两次,每次灌胃量均为当天总灌胃量的一半,两次灌胃间隔时间超过8 h,每3天称一次体重,连续60 d。灌胃期间各组大鼠自由进水、饮食自由。

1.4 大鼠血压、左室内压力的测定 20%水合氯醛(4 mL·kg-1)腹腔注射麻醉动物后,行右颈总动脉插管,经压力传感器与BL-420S生物信号处理系统相连,描记一段颈动脉压波形后,继续行左心室插管,再描记一段左心室压力曲线,以MFL Lab200心功能软件计算平均颈动脉收缩压(systolic blood pressure,SBP)、左心室内压(left ventricle pressureLVP)。

1.5 血浆AngⅡ的含量测定 大鼠血压、左室内压力的测定后,沿腹部正中线打开腹腔,分离下腔静脉,取2 ml血液注入抗凝管中(每管含20μl 0.30M EDTA,20μl 0.34M 8-羟基喹啉硫酸盐,10μl 0.32M 二巯基丙醇),再取2 ml于存有肝素的抗凝管中,分别盖好试管上下颠倒混匀后立刻投入冰水浴中,静置1~2 h后以2 500转/分4℃离心7 min,分离血浆。-80℃低温冰箱保存。采用放射免疫方法测定血浆AngⅡ含量,严格按试剂盒说明书操作。

1.6 大鼠左心室质量/体质量指数 (left ventricular weight/body weight,LVW/BW)采血后,迅速开胸取出心脏,预冷的生理盐水冲洗干净,清洁滤纸吸干水分,电子天平称取左心室(含室间隔),计算LVW/BW。

1.7 心肌组织形态学和电镜观察 一部分心肌组织用10%中性甲醛溶液固定,常规组织切片制作。经脱水、透明、透蜡后进行石蜡包埋,5μm连续切片,苏木精-伊红染色,光学显微镜观察。另一部分心肌组织用2.5%戊二醛溶液固定,再行脱水、包埋、切片并染色后进行透射电镜观察。

1.8 实时定量PCR检测心肌AT1 mRNA的表达心肌总RNA提取和纯化按照试剂盒说明进行。采用Eppendorf M aster-cycler Gradient PCR仪逆转录后,通过iCycler iQ real-time PCR仪进行扩增。引物设计为:AT1上游引物 5'-GTGGGCCGCTCTAGGCACCAA -3',下游引物 5'- CTCTTT-GATGTCACGACGATTTC-3,扩增片段 320bp。β-actin上游引物 5'-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA -3',下游引物 5'- GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3',扩增片段150bp。反应条件:95℃ ,8 min30 s循环 1 次;95℃ 5 s,60℃ 20 s 循环40次。以Ct值为统计参数依次计算下列数据:①平均Ct=(Ct1+Ct2)/2(重复管);②dCt=平均Ct-中间值;③基因的表达以2△(-dCt)表示;④以目的基因的表达/β-肌动蛋白基因的表达对AT1 mRNA进行相对定量。

1.9 统计学处理 利用SPSS 13.0统计软件进行统计分析。数值变量资料经正态性和方差齐性检验后,满足条件者行F检验,有差异者进一步做两两比较的q检验(SNK检验),数据采用表示,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验期间各组大鼠行为学比较 实验期间,灌胃2周时低剂量组、高剂量组大鼠行为与对照组无明显不同。2周后高剂量组大鼠灌胃时出现抗拒行为,灌胃后出现烦躁不安、行走不稳,症状持续时间随实验的进行而逐渐延长。低剂量组与对照组之间没有明显差异。

2.2 食用白酒对大鼠心功能的影响 由表1结果可见,灌胃2月后,高剂量组收缩压(SBP)、左室内压(LVP)与低剂量组、对照组比较均有下降,但无显著性差异(P>0.05)。低剂量组与对照组相比无明显差异(P>0.05)(见表1)。

表1 食用白酒对各组SBP和LVP的影响

2.3 食用白酒对大鼠左心室质量/体质量(LVW/BW)的影响 由表2结果可见,灌胃2个月时,高剂量组的BW、LVW及LVW/BW均略高于低剂量组、对照组,但无显著差异(P>0.05)。低剂量组与对照组之间比较也无明显差异(P>0.05)。

表2 食用白酒对各组LVW/BW的影响

2.4 大鼠心肌组织HE染色结果和电镜结果 光镜下,低剂量组和对照组心肌纤维结构正常,高剂量组心肌细胞有部分区域空泡样变性(见图1)。电镜下,高剂量组心肌细胞核水肿,部分出现双核仁,有空泡样变性,线粒体明显肿胀,嵴断裂,部分出现絮状变,肌丝排列紊乱,出现大量脂滴,肌丝间可见吞噬溶酶体(见图2)。

2.5 食用白酒对大鼠血浆AngⅡ的含量的影响灌胃2月后,低剂量组(n=8)AngⅡ含量(1310.82±133.31)pg/mL,高剂量组(n=8)AngⅡ含量(1155.90 ±286.37)pg/mL,对照组(n=8)AngⅡ含量(1234.89 ±131.38)pg/mL,各组间血浆 AngⅡ含量比较无显著性差异(P>0.05)。

2.6 食用白酒对心肌组织AT1受体mRNA表达的影响 灌胃2月后,高剂量组AT1 mRNA表达降低,与低剂量组和对照组组比较有显著性差异(P<0.01)。低剂量组与对照组之间无明显差异(P>0.05)(见表3)。

表3 食用白酒对各组大鼠心肌组织AT1 mRNA表达的影响

3 讨论

近几十年来,由于生物化学、免疫组织化学特别是分子生物学技术的广泛应用,对于心血管系统内分泌的研究结果证明,尚有独立于循环RAS之外的RAS系统,其来源、作用机制与前者皆有不同,故称为组织RAS系统。组织RAS具有双重调节的作用,它既受自身RAS本身的调节,又受循环中的RAS的调节。在RAS系统中AngⅡ是起关键作用的效应肽。在心脏内,AngII既可以由循环RAS产生,也可以由自身RAS产生。AngⅡ主要通过作用于其Ⅰ型受体促进血管平滑肌细胞增殖、血管内皮细胞增生、心肌细胞肥大和心肌间质纤维化重塑[4]。新近一些研究表明慢性酒精摄入激活 RAS,通过 AngⅡ发挥心脏重构作用[5]。

ACM主要引起以左室肥厚为主心脏扩大,它以心肌重量增加、左室甚至全心扩张、心室壁由早期的代偿肥厚至后期的失代偿变薄、左室舒张和收缩功能障碍、心力失常以及充血性心力衰竭等改变为特征[6]。本实验结果显示:灌酒2个月,低、高剂量组大鼠的收缩压,左室内压,左心室质量/体质量,及血浆AngⅡ与对照组比较均无显著性差异。光学显微镜下,低剂量组大鼠心肌纤维结构无明显变化,高剂量组大鼠心肌纤维排列紊乱;而电镜下高剂量组大鼠的心肌细胞出现双核,线粒体肿胀,出现絮状变等变化。RT-PCR显示高剂量组与低剂量组和对照组比较心肌中AT1受体mRNA表达明显降低。

我们推测:灌酒2个月,大鼠ACM发生在早期,尽管心肌细胞发生了超微结构的病变,但心脏功能处于代偿期,因此收缩压,左室内压,左心室质量/体质量无明显改变。同时检测血浆AngⅡ含量尚无变化,有研究表明,糖尿病大鼠在糖尿病(diabetes mellitus,DM)发生10~12周时有心肌细胞增生和心肌细胞间质胶原沉积,此时心肌局部AngII含量已明显升高,血浆AngII也从发病3个月开始升高[7],提示灌酒2个月,心脏功能处于代偿期,尚未引起血浆AngII含量的变化,表明心脏局部RAS在ACM的发生发展中起着非常重要作用,也说明白酒对大鼠心肌的损伤,出现酒精性心肌病变是一个很长的过程;这与饮酒的剂量和时间的长短有关系。对于高剂量组大鼠的心肌AT1受体mRNA表达明显降低,我们推测可能是乙醇及乙醇的代谢产物乙醛损伤心肌,使得心肌局部分泌AngⅡ,AngⅡ浓度升高,高浓度AngⅡ负反馈抑制AT1RmRNA的表达所致,也有可能与食用白酒的其他非酒精成分有关,这有待进一步研究。

[1]曹斯琦,陈丁丁.酒精性心肌病:病理生理,临床与药理学[J].海峡药学,2006,18(4):4 -8.

[2]陈筱潮,徐明彤.心血管系统内分泌学[M].中山大学出版社,2007.

[3]于茜,钟久昌,朱鼎良.肾素-血管紧张素系统与心肌纤维化及重塑[J].心血管康复医学杂志,2009,18(6):608-609.

[4]房晓祎,李玉光.血管紧张素Ⅱ致心肌肥厚的分子生物学基础[J].汕头大学医学院学报,2003,16(1):48-50.

[5]李云霞,蔡久英.饮酒与心血管疾病[J].心血管病学进展,2008,29(3):462 -465.

[6]徐忠.培多普利对酒精性心肌病并心力衰竭患者左室重构的影响[J].中华全科医学,2008,6(9):909-910.

[7]张一驰,牟艳玲,解砚英.糖尿病心肌病与肾素-血管紧张素系统及其干预药物[J].中国药学杂志,2011,46(16):1317-1319.

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