小鼠抗食蟹猴IgG单克隆抗体的制备

张段玲，张彦龙，白素英

(东北林业大学，哈尔滨 150040)

小鼠抗食蟹猴IgG单克隆抗体的制备

张段玲，张彦龙，白素英

(东北林业大学，哈尔滨 150040)

目的 制备抗食蟹猴、恒河猴等非人灵长类实验动物免疫球蛋白二级抗体，开展对其传染病血清学快速诊断方法的建立。方法 采用饱和硫酸铵盐析、Agarose-Protein G亲和层析技术，从食蟹猴血清中提纯 IgG。经SDS-PAGE电泳鉴定，采用常规法免疫C57BL/6小鼠，三次免疫后取脾细胞与 Sp2/0-Ag14骨髓瘤细胞通过PEG4000融合制备杂交瘤细胞，利用间接ELISA、Western blot等方法进行筛选、鉴定。结果 得到5株阳性杂交瘤，分别命名为2B6、2B7、2D9、3B2、5E4，并且5株杂交瘤分泌的抗体均与恒河猴的 IgG或血清发生交叉反应，而与其他物种如东北虎、犬等动物的IgG或血清无交叉反应。结论 5株杂交瘤产生的单克隆抗体(McAb)具有较好免疫活性，且能长期、稳定地分泌抗体。此项研究工作为后续研究食蟹猴、恒河猴传染病血清学诊断方法奠定基础。

食蟹猴;IgG;单克隆抗体;亲和层析

食蟹猴(Macaca fascicularis)属于灵长目(primates)猴科(Cercopithecidae)猕猴属。现阶段我国养殖的实验猴主要是猕猴属的食蟹猴和恒河猴，其中食蟹猴为外来种，两者均被列入《濒危野生动植物种国际贸易公约(CITES)》附录Ⅱ中［1］。猕猴属动物亲缘关系上和人类比较接近，与人类遗传物质有75%～98.5%的同源性，是研究人类疾病的理想动物模型，被广泛的应用于传染病、遗传性疾病、心血管疾病、内分泌疾病、药理学和毒理学等研究领域［2－4］。但是食蟹猴及其他非人类灵长类患病种类繁多，如 B病毒、猴痘、猴结核、猴副流感、麻疹病毒病、肝炎病毒病等［5－8］。因此需要建立相应的诊断方法，以便对所用实验猴进行彻底的检查，排除疾病个体。目前我国虽然已建立一些诊断方法，但仍没有一个完善的方法满足实验猴疾病的排查和筛选，血清学方法是诊断疾病的有效手段之一，制备抗免疫球蛋白二级抗体是开展血清学诊断研究工作的前提。

本文针对食蟹猴IgG制备其单克隆抗体，并鉴定此抗体与恒河猴免疫球蛋白抗原相关性，为以后开展非人灵长类动物疾病血清学诊断方法及诊断试剂盒的研制奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 食蟹猴血清、细胞及实验动物

食蟹猴血清由东北林业大学野生动植物检测中心白素英老师惠赠［SCXK(琼)2004-0001］。SP2/0骨髓瘤细胞，本实验室保存。C57BL/6小鼠，购自哈尔滨医科大学肿瘤防治研究所［SCXK(黑)2005-2007］。

1.2 试剂

鉴定 McAb 的亚型诊断试剂盒为SBA ClonotypingTMSystem/HRP，SouthernBiotech，Cat．No．5300-05;RPMI-1640 培 养 基，GIBCO，Cat．No．3180022;HATMediaSupplement(50×)Hybri-MaxTM，Sigma，Cat．No．H0262;HT Media Supplement(50 × )Hybri-MaxTM Sigma，Cat．No H0137;Anti-Mouse IgG，Sigma，Cat．No A4416;Freund’s complete adjuvant(FCA)Sigma， Cat． No． F5881;OPhenylenediaminedihydrochloride(OPD)，Sigma，Cat．No P9187。

1.3 IgG制备及纯度鉴定

采用饱和硫酸铵盐析和Agarose-Protein G亲和层析分离纯化，按文献［9］的方法，取10 mL食蟹猴血清和40 mL冷的50 mmol/L PBS(pH7.2)缓冲液，在冰上加入硫酸铵粉末，边加边搅拌，最终浓度在22%，离心去除沉淀，上清液继续加入硫酸铵粉末终浓度55%，在4℃下放置4 h，离心回收沉淀，并溶解在50 mmol/L磷酸盐缓冲液中，透析在50 mmol/L磷酸盐缓冲液中，中间三次换液并过夜透析。次日回收透析液，离心除去不溶物。上清液加入硫酸铵粉末至终浓度33%，在4℃下搅拌并静止4 h，离心收集沉淀，透析于20 mmol/L磷酸盐中，换液3次并过夜，回收透析液，并12000 rpm离心10 min，去掉不溶性蛋白备用。层析法是将Agarose-PreoteinG在超纯水中膨胀30～60 min后装柱，经5～10倍体积的20 mmol/L磷酸盐平衡后，上柱、洗脱，并收集洗脱液定量。用SDS-PAGE对提纯的IgG纯度进行鉴定，纯化后的IgG－80℃保存。

1.4 小鼠免疫及细胞融合

取6～8周龄雌性 C57BL/6小鼠，初次免疫为FCA乳化抗原，皮下多点注射，抗原用量为250 ug/只，间隔2周，进行FIA加强免疫1次，第3次用纯化的IgG腹腔直接免疫，4 d后取脾脏，分离细胞，骨髓瘤细胞1×107个/mL与已免疫的小鼠脾细胞1×108个/mL混合，用 50%的 PEG4000/RMPI-1640进行融合制备杂交瘤。

1.5 杂交瘤细胞的筛选

按常规间接ELISA方法，融合10 d后，以100 ng/孔纯化后的食蟹猴IgG作检测抗原包被ELISA板，3%BSA封闭1 h，取融合细胞上清液进行检测，并以SP2/0培养上清和免疫小鼠血清分别做阴阳性对照，加二抗，显色，ELISA读数，判定标准为P/N＞2.1为阳性。采用有限稀释法对所选择阳性杂交瘤细胞进行连续3次克隆，3次克隆化后结果均为阳性者，判断为能稳定分泌抗食蟹猴IgG抗体的杂交瘤细胞株。扩大培养并分批冻存杂交瘤细胞。

1.6 单克隆抗体(McAb)的免疫原性检测

McAb的免疫原性通过Western blot检测，取纯化后及粗提的食蟹猴 IgG进行 SDS-PAGE;通过半干转移法转移到 PVDF膜上，3%BSA 37℃封闭1 h;在摇床上用 PBST洗膜5次，然后分别与杂交瘤2B6、2B7、2D9、3B2、5E4上清 37 ℃ 作用 1 h，清洗;再与HRP标记的羊抗鼠 IgG 37℃作用1 h，清洗;ECL-Kit显色后，立即暗室曝光、洗相。

1.7 McAb腹水制备及效价的测定

按照常规方法，选8～10周龄 C57BL/6小鼠腹腔每只注射0.5 mL液体石蜡。7 d后，以1×106个杂交瘤细胞/mL，0.5 mL每只小鼠，腹腔注射。一般7～10 d左右，便可以采集腹水。取得腹水后，腹水经离心、硫酸铵沉淀、Protein G-Agarose亲合层析纯化得到纯度较高的单克隆抗体。然后通过间接ELISA方法进行效价测定，100ng/孔包被食蟹猴IgG，方法同杂交瘤细胞的筛选。

1.8 McAb特异性鉴定

通过间接ELISA，以犬血清、貉血清、东北虎血清、恒河猴血清各50 uL/孔以及纯化后的 IgG各100 ng/孔作为抗原包被酶标板，以杂交瘤培养上清为一抗，方法同杂交瘤细胞的筛选。同时以纯化后的犬、貉、东北虎、猕猴免疫球蛋白，通过 SDS-PAGE电泳与 Western blot鉴定 MAb的特异性，方法同McAb的免疫原性检测。

1.9 McAb亚型鉴定

单克隆抗体的亚型的鉴定，参照 SBA ClonotypingTMSystem/HRP说明书所描述方法进行操作。

2 结果

2.1 SDS-PAGE鉴定IgG

经饱和硫酸铵沉淀得粗提食蟹猴IgG和经Protein G-Agarose亲和层析后食蟹猴IgG通过SDSPAGE电泳后，结果如图1所示，重链的分子量约55×103，轻链约28×103，符合哺乳动物的 IgG的分子量。

2.2 McAb免疫活性检测

采用Western blot法检测5株单克隆抗体与粗提、纯化后的食蟹猴 IgG的结合活性，结果表明2B6、5E4、2B7、2D9、3B2均与重链反应，5 株杂交瘤均具有良好的免疫活性。

图1 SDS-PAGE IgG鉴定Fig．1 SDS-PAGE identify the IgG

2.3 McAb腹水效价

小鼠腹水经纯化后，2D9、3B2的腹水效价分别为 1∶25600，1∶51200。2B7、5E4、2B6的 ELISA 效价为1∶12800，杂交瘤细胞经多次传代冻存复苏，诱生腹水抗体分泌特性稳定。

2.4 McAb特异性鉴定

McAb与纯化后的食蟹猴、恒河猴 IgG，食蟹猴血清、恒河猴血清均反应，而与东北虎、犬的血清及其IgG均不反应。说明食蟹猴与恒河猴IgG具有相同的抗原表位，如表1可见。

2.5 McAb亚型鉴定

用单克隆抗体亚型鉴定试剂盒测定杂交瘤细胞培养上清中单克隆抗体的亚型，结果表明5E4、2B6、2B7为 IgG2b 型，3B2为 IgG3 型，2D9为 IgG1 型。2B7、2B6、5E4、2D9轻链均为 κ 型，3B2 为 λ 型。

表1 ELISA鉴定结果Tab．1 Result of ELISA evaluation

3 讨论

据2009年统计，我国实验猴的存栏量21万只，其中恒河猴近3万只，食蟹猴18万余只［11］。食蟹猴、恒河猴因与人类有很近的亲源关系，遗传基因相似，广泛应用于人类医学研究，是重要的动物实验模型，但是由于携带多种疾病，因此需要加强非人灵长类的疾病检测，保证实验顺利开展至关重要。

为此，从食蟹猴血清中，通过饱和硫酸铵沉淀和亲和层析技术，由SDS-PAGE检测结果表明所得到的食蟹猴IgG纯度较高。虽然粗提条带相对于亲和层析有少量杂带，但其纯度仍相当客观，所以在需要制备大量粗提抗体时，加入固体饱和硫酸铵沉淀法从仪器设备、温度、价格、活性、纯度等方面考虑，有很大优势，值得推广使用。而亲和层析法相对于其他提纯方法价格虽比较昂贵，但其可以在简单的试验条件里，快速得到所需高纯度样品。二者联合运用，即经济，效果也客观，在制备各种动物免疫球蛋白二级抗体方面，可优先考虑。

本研究利用细胞融合技术，成功制备了5株能稳定分泌抗食蟹猴IgG的杂交瘤细胞。从单克隆特异性鉴定结果表明，每孔均包被100 ng纯化后的IgG，这5株杂交瘤所分泌单克隆抗体均与食蟹猴、恒河猴纯化后的IgG、血清反应，差别是血清反应性较纯化的IgG弱些，有可能跟血清中IgG相对浓度比纯化后的浓度低有关。食蟹猴、恒河猴两个物种的反应强度相似，说明食蟹猴、恒河猴IgG具有较高的共同抗原表位。这可能与它们亲缘关系较近有关。单克隆抗体为以后研究这两种实验动物疾病血清学诊断、人IgG特性比对，提供了基础。

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Preparation Monoclonal Antibodies Of Mice Against Macaca fascicularis IgG

ZHANG Duan-ling，ZHANG Yan-long，BAI Su-ying
(Northeast Forestry University，Harbin 150040，China)

ObjectiveIn order to prepare immunoglobulin G(IgG)secondary antibody of non-human primates such as Macaca fascicularis and Macaca mulatta and establish a quick serological method to diagnose their diseases．MethodsMacaca fascicularis IgG was isolated and purified from Macaca fascicularis serum by precipitated use saturated ammonium sulfate and affinity chromatography technology with Agarose-Protein G．After identified by SDS-PAGE electrophoresis murine monoclonal antibody(McAb)were produced by conventional immune method and hybridoma technology．Monoclonal antibody was produced when C57BL/6 mice was immunized three times and its spleen cells were fused with SP2/0-Ag14 myeloma cells．Indirect ELISA and Western blot methods were used for identification．Result5 strains of myeloma cells acquired which were named 2B6，2B7，3B2，5E4，2D9．The antibodies they secret can all react well with both IgG and their serum of Macaca fascicularis and Macaca mulatta．There are no cross reaction with other species such as east-northern tigers and dogs．ConclusionThe 5 strains of monoclonal antibodies can secrete antibody chronically and steadily．The study can be valuable in establishing a quick serological method in diagnosing the infectious disease．

Macaca fascicularis;IgG;Affinify chromatography;Monoclonal antibody

R332

】A

1671-7856(2012)05-0068-04

10．3969/j．issn．1671．7856．2012．05．015

国家林业局疫源疫病监测项目《我国境内不同种属猴免疫球蛋白同源性分析及其单克隆抗体的制备》。

张段玲(1988－)，女，硕士，研究方向:动物传染病。

张彦龙(1968－)，E-mail:zhangynlng@yahoo．com．cn。

2012-03-23