不同中医证型艾滋病患者CD4+T淋巴细胞增殖与凋亡的初步探讨＊

马建萍，马秀兰，张 颖，艾合买提，李静茹，曾 琳

(新疆国家中医临床研究基地艾滋病研究室，乌鲁木齐 830000)

HIV病毒侵袭人体后，病毒选择性地吸附在靶细胞的CD4+T淋巴细胞受体上产生一系列的反应，最终通过对CD4+T淋巴细胞的破坏达到对机体免疫系统的破坏［1］。HIV gp120、gp41与 CD4+T 淋巴细胞的CD4分子及CCR5结合，直接感染CD4+T淋巴细胞，还可通过“旁观者”效应和活化诱导的细胞凋亡机制，导致感染和非感染的CD4+T淋巴细胞死亡［2］，造成CD4+T淋巴细胞的严重免疫缺陷，这是HIV感染导致CD4+T淋巴细胞数量减少的主要原因。本研究通过对不同中医证型艾滋病患者CD4+T淋巴细胞增殖与凋亡的情况进行比较分析，探讨中医证型与CD4+T淋巴细胞增殖与凋亡的关系。

1 材料与方法

1.1 一般资料

所有艾滋病患者均来自2011年10月 ～2011年11月在新疆乌鲁木齐市沙依巴克区疾病预防控制中心随访的患者，并签署知情同意书。初诊时根据患者症状、舌、脉象，按照中医辨证分型分为气阴两虚肺肾不足、肝肾阴虚湿毒蕴结、气郁痰阻瘀血内停3组，共收集病例79例，其中气阴两虚肺肾不足型25例，肝肾阴虚湿毒蕴结型28例，气郁痰阻瘀血内停型26例。气阴两虚肺肾不足型年龄23～46岁，平均(35.96±7.03)岁;肝肾阴虚湿毒蕴结型年龄19～49岁，平均(35.79±7.07)岁;气郁痰阻瘀血内停型年龄26～49岁，平均(37.12±5.00)岁。3组患者均未接受高效抗逆转录病毒疗法(Highly Active Antiretroviral Therapy，HAART)治疗。

1.2 辨证分组

按照中医辨证分型的方法，参照《艾滋病中医诊疗指南》(中国中医药出版社，中华中医药学会防治艾滋病分会编，2008年)、《中医药治疗艾滋病临床技术方案》(试行)、《中医诊断学》，由两名副主任医师以上职称的中医大夫现场辨证，分为气阴两虚肺肾不足、肝肾阴虚湿毒蕴结、气郁痰阻瘀血内停3组。

1.3 淋巴细胞增殖与凋亡的观察

清晨取患者空腹静脉血5mL，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝;试剂使用 BD公司生产的 Annexin V及Ki-67试剂，以Ki-67标记细胞增殖，Annexin V标记细胞凋亡;通过BD公司流式细胞仪FACS Calibur计数。

1.4 实验室检测步骤

1.4.1 细胞凋亡步骤 (1)取100ul全血，加2ml溶血素(专用)，室温放置 10min，离心(1500r/5min)去上清。加入2ml Binding Buffer(1×)-蒸馏水10倍稀释，离心去上清;(2)加抗体(Annexin VFITC，PI)5μL，4℃ 孵育 15min。加 400μL Binding Buffer;(3)上机检测。流式细胞仪BD Facs calibur。获取分析软件Cell quest Pro。上机获取10000个淋巴细胞。

1.4.2 Ki-67检测步骤 (1)细胞表面染色(取10ul CD4-Percp抗体)，加100ul全血，室温避光15min。加入固定破膜剂 A100ul，固定5min;(2)加入2ml溶血素，室温放置10min，离心(2000r/5min)去上清;(3)加入固定破膜剂B50ul，同时加入胞内染色抗体Ki-67 10ul，对照管加入10ul Mouse IgG1-FITC。室温避光30min;(4)加入2ml PBS混匀、离心(2000r/5min)去上清;(5)加入500ul PBS，上机检测(步骤同上)。

1.4.3 CD4+T淋巴细胞的检测 取患者新鲜抗凝血标本100，放入样品测定管，加入相应的荧光标记单克隆抗体，振荡混匀，室温下避光孵育20～30min，加入溶血素，溶血完毕后上机检测。采用流式细胞仪BD Facs calibur，获取分析软件 Cell quest Pro，上机获取10000个淋巴细胞，对CD4+T淋巴细胞的百分比进行检测分析。

1.5 统计学方法

应用统计软件SPSS 17.0进行处理。所有数据均以均数±标准差(±s)表示，各组之间CD4+T淋巴细胞的比较在方差齐、符合正态性分布的条件下采用单因素方差分析;各组间两两比较采用LSD检验方法，方差不齐、不符合正态性分布的条件下采用秩和检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CD4+T淋巴细胞占淋巴细胞比率

表1显示，在3种不同证型患者的CD4+T淋巴细胞比率进行比较，其差异有统计学意义。表2显示，经两两比较，肝肾阴虚湿毒蕴结型和气郁痰阻瘀血内停型之间差异有统计学意义。

表1 不同证型患者淋巴细胞中CD4+细胞比率的比较

2.2 淋巴细胞凋亡比较

表3显示，对于3种不同中医证型患者血清淋巴细胞凋亡百分比进行比较，以Annexin V-PI标记细胞凋亡。3组患者淋巴细胞凋亡率比较差异无统计学意义。

表2 不同证型间淋巴细胞中CD4+细胞比率的两两比较

表3 不同中医证型患者血清淋巴细胞凋亡的比较

2.3 淋巴细胞增殖的比较

表4显示，对于3种不同中医证型患者血清淋巴细胞增殖进行比较，以 Ki-67标记细胞的增殖。在3种不同中医证型间，患者淋巴细胞增殖情况比较差异无统计学意义。

表4 不同中医证型患者血清淋巴细胞增殖的比较

2.4 CD4+T细胞增殖的比较

表5显示，对于3种不同证型患者血清CD4+T淋巴细胞的增殖进行比较，在3种不同中医证型间，患者CD4+T淋巴细胞增殖情况的差异无统计学意义。

表5 不同证型患者血清CD4+T淋巴细胞增殖的比较

3 讨论

文献研究报道［3］，HIV/AIDS患者 CD4+T淋巴细胞计数分布与证型有相关性，CD4+T淋巴细胞计数在200/μL以下时，以气虚血瘀、邪毒壅滞型和脾肾亏虚、湿邪阻滞型多见;计数在201～350/μL之间时，以气虚血瘀、邪毒壅滞型，气阴两虚、肺肾不足型和脾肾亏虚、湿邪阻滞型多见;计数大于350/μL时，以气血两亏型和气虚血瘀、邪毒壅滞型多见。本研究是以患者CD4+T细胞占淋巴细胞的比率进行比较，在3组不同证型间差异有统计学意义。其中肝肾阴虚湿毒蕴结型与气郁痰阻瘀血内停型之间CD4+T淋巴细胞的比率有差异。由此可见，CD4+T淋巴细胞可作为中医证型判别的依据，其绝对值和相对值均可为中医证型的判别提供参考。

细胞凋亡和细胞增殖都是生命的基本现象，是维持体内细胞数量动态平衡的基本措施。在胚胎发育阶段通过细胞凋亡清除多余的和已完成使命的细胞，保证了胚胎的正常发育;在成年阶段通过细胞凋亡清除衰老和病变的细胞，保证了机体的健康。与细胞增殖一样，细胞凋亡也是受基因调控的精确过程。

研究表明［3］，HIV感染者CD4+T淋巴细胞的减少与细胞凋亡有密切关系，通过检测 HIV感染者CD4+T淋巴细胞凋亡率有助于判断疾病进程。

随着中医药的发展，中医药在艾滋病的诊疗过程中发挥着日益重要的作用。深入研究中医理论，运用现代医学的手段和方法有助于更好地认识和推广中医。本研究的目的旨在通过对不同中医证型间CD4+T淋巴细胞增殖与凋亡的关系进行比较，以探索中医分型与免疫学的关系。经过本实验，在不同中医证型间患者CD4+T淋巴细胞的增殖与凋亡差异无统计学意义。由于本研究所选取的患者均为AIDS患者，其CD4+T淋巴细胞的增殖与凋亡没有差异，提示其细胞增殖与凋亡处于相同水平。但是3组患者CD4+T淋巴细胞比率存在差异，提示造成其差异的原因可能除了细胞增殖与凋亡外，还有其他因素。

在细胞凋亡的试验过程中，由于采用的CD4-PERCP与PI是一个发射波长，所以不能够对CD4+T淋巴细胞的凋亡进行分析，仅对淋巴细胞的凋亡进行了分析。在今后的工作中，可以进一步对此进行研究。

［1］林云霞，刘学真，郑薇，等.山东省全球基金艾滋病项目地区抗病毒治疗病人CD4+T细胞计数变化分析［J］.中华疾病控制杂志，2009，13(4):484-485.

［2］曾耀英.HIV感染发病学的新概念［J］.河南中医学院学报，2005，20(4):1-5.

［3］王晓雪，危剑安，宋春鑫，等.320例经血感染HIV/AIDS中医证型分布与 CD4+T淋巴细胞计数、病毒载量关系的探讨［J］.世界中西医结合杂志，2010，5(5):410-413.