HPA轴抑制大鼠感染性休克模型的建立及四逆汤对该模型的作用*

代 蓉，董柳慧，石安华，淤泽溥

(云南中医学院基础医学院，云南昆明 650500)

近年来，虽然抗感染治疗和器官功能支持技术取得了长足的进步，但严重感染的病死率仍高达30% ～50%［1-2］。临床流行病学资料显示，感染性休克是危重病患者的主要死亡原因之一，现已成为进一步提高危重症救治成功率的最大障碍［3］。针对严重感染和感染性休克的发生率和病死率均居高不下，提高对该症的认识、探索有效的治疗方法和药物，无疑具有重要的理论价值及临床意义。

四逆汤是《伤寒论》中回阳救逆的著名方剂，厥阴病之表热里寒、下利、大汗、手足厥冷等，均可使用四逆汤治疗［4-5］。多项临床及药理研究亦表明，四逆汤对多种休克具有一定的治疗作用，但以往开展的与其作用机制相关的药理研究主要集中于强心和改善微循环等方面展开，尚不能很好解释其回阳救逆功效的科学内涵。

近年来的研究认为HPA轴作为脓毒症时神经内分泌系统重要的调控途径，休克时HPA轴的负反馈调节机制受损，可导致内分泌系统功能紊乱，表现为相对性肾上腺皮质功能不全 (RAI)，调节肾上腺皮质的功能状态可能是感染性休克治疗的新途径。本研究从复制HPA轴抑制动物模型入手，在HPA轴抑制动物模型复制成功的基础上，再注射内毒素，进一步复制成HPA轴抑制大鼠感染性休克模型。探讨四逆汤对该模型HPA轴的影响，现将结果报道如下。

1 实验材料

1.1 实验动物

SD大鼠，清洁级，体质量 (250±20)g，雄性。购自四川省医学科学院实验动物研究所，动物合格证号:SCXK(川)2009-16。实验前动物先适应性饲养1周，给予标准普通饲料和充分的饮用水，均为自由进食、自由饮水。饲养于云南中医学院实验动物室。

1.2 药品和试剂

四逆汤所用药材炙甘草、干姜购于昆明市中医院，附子购于四川江油中坝附子科技发展有限公司，地塞米松 (DEX)，天津金耀氨基酸有限公司，批号:0901132;皮质酮，购于 INTERNATIONAL LABORATORY USA公司;批号349610;脂多糖 0111:B4，购于 sigma公司，批号:029K4022。

ACTH试剂盒，购于北京普尔伟业生物科技有限公司，批号:20100225;CORT试剂盒，购于南京建成生物工程研究所，批号:EPE0576R。

1.3 实验用药的制备

采用《伤寒论》中四逆汤原始组方，按汉代剂量单位换算，四逆汤方为:炙甘草31.2g，干姜23.4g，附子15g。实验用方药的制备按文献［6-9］所记载方法进行，药液浓缩成稠浸膏分装置于冰箱冷冻保存备用。

1.4 主要仪器

酶标仪:Molecular Device Corporation型号为340PC;放免仪:自动放免仪，中国科大中佳公司;RM6280型多道生理信号采集处理系统:成都仪器厂。

2 方法和结果

2.1 四逆汤对皮质酮致HPA轴抑制大鼠的影响

［10-11］方法，雄性清洁级SD大鼠80只，体质量200～250g，随机分为正常组、模型组、四逆汤高、低剂量组，每组20只。(1)正常组:每天1次皮下注射等体积橄榄油，连续14d;(2)四逆汤高、低剂量组:低剂量为人用量的等效剂量，即6.25g/kg;高剂量为人用量的6倍量，即37.5g/kg。每天1次灌胃四逆汤，直至实验结束。第4天开始，在每天灌胃给药的同时，同模型组方法造模;(3)模型组:按10mg/kg体质量皮下注射皮质酮 (Corticosterone，CORT)，每天1次，连续14d。各组动物自由摄食摄水。实验第18天，各组大鼠水合氯醛麻醉，腹主动脉取血，37℃水浴放置1h，3 000转离心15min，取上清液，-40℃保存待测。造模后，隔天记录各组大鼠体质量;参照文献方法［10-11］酶联免疫法测定各组大鼠血清CORT含量、放射免疫法测定大鼠血清促肾上腺皮质激素 (AdrenoCorticoTropic Hormone，ACTH)含量;取各组大鼠肾上腺，计算肾上腺指数 (肾上腺指数=左右肾上腺质量之和mg/大鼠体质量g);取各组大鼠肾上腺，做病理组织学观察。实验结果见表1、表2:

表1 四逆汤对皮质酮致HPA轴抑制大鼠CORT、ACTH含量的影响 (x±s，n=20)

由表1可知，模型组CORT、ACTH含量比正常组降低 (P＜0.05)，表明HPA轴抑制，CORT、ACTH分泌减少;与模型组相比，四逆汤高剂量组大鼠血清CORT、ACTH含量升高 (P＜0.05、P＜0.01)，四逆汤低剂量组大鼠血清CORT含量也显著升高 (P＜0.01)，提示四逆汤能够对抗HPA轴抑制状态。

表2 四逆汤对皮质酮致HPA轴抑制大鼠肾上腺指数的影响 (x±s，n=20)

由表2可见，模型组与正常组肾上腺指数比较，肾上腺指数明显减轻 (P＜0.01)，提示长时间外源性给予皮质酮，能使肾上腺萎缩;四逆汤高剂量组与模型组肾上腺指数比较，肾上腺指数增加(P＜0.05)，提示四逆汤高剂量能减轻皮质酮致HPA轴抑制大鼠肾上腺萎缩。

2.2 四逆汤对皮质酮致HPA轴抑制大鼠感染性休克模型的影响

参考文献［10，12-13］，清洁级雄性SD大鼠70只，体质量250～270g。随机分为7组:即正常组、模型组、阳性组、四逆汤预防给药高、低剂量组、四逆汤治疗给药高、低剂量组，每组10只。(1)正常组:每天1次皮下注射等体积橄榄油，连续14d;(2)四逆汤预防给药高、低剂量组:高低剂量的设置同前，每天1次灌胃四逆汤，直至实验结束。第4天开始，在每天灌胃给药的同时，同模型组方法造模;(3)模型组、阳性组、四逆汤治疗给药高、低剂量组:按10mg/kg体质量皮下注射皮质酮，每天1次，连续14d。各组动物自由摄食摄水。实验第18天，四逆汤预防给药高、低剂量组动物灌胃四逆汤1次，2h后各组大鼠水合氯醛麻醉，动物仰位固定在手术台上，分离左侧颈总动脉，取一内充0.3%肝素生理盐水的聚乙烯导管，插入左颈总动脉，此动脉导管与压力换能器相连。用RM6280C型多道生理记录仪记录动脉血压。稳定半小时，记录基础血压，各组动物腹腔注射LPS(4mg/kg)。注射 LPS后，阳性组腹腔注射DEX(5mg/kg)1次，四逆汤治疗组灌胃四逆汤1次 (1mL/100g)。记录注射LPS后3h血压。参考文献［12-13］标准，若平均动脉压下降幅度超过基础血压值的20%，且持续20min以上，可认为实验性感染性休克模型成功建立。记录注射LPS前基础血压，及注射LPS后3h血压值。结果见表3。

表3 四逆汤对HPA轴抑制感染性休克模型大鼠平均动脉压的影响 ±s，n=10)

表3 四逆汤对HPA轴抑制感染性休克模型大鼠平均动脉压的影响 ±s，n=10)

注:与正常组比＊＊P＜0.01;与模型组比△△P＜0.01;与治疗高剂量比#P＜0.05

92.10±17.53 67.65±15.22 26.87±4.88模型组 87.85±35.52 60.28±28.33 34.79±11.69＊＊DEX组 5mg/kg 93.10±16.79 71.15±11.34 22.99±9.60△△预防高剂量组 37.5g/kg 100.01±40.60 83.40±30.06 14.91±5.05△△预防低剂量组 6.25g/kg 76.50±18.36# 60.70±16.12 20.90±5.74△△治疗高剂量组 37.5g/kg 105.23±32.23 92.54±26.80 11.71±1.31△△治疗低剂量组 6.25g/kg 101.53±19.27 86.02±8.80 14.08±6.89 100正常组组别 剂量 给LPS前血压/mmHg A给LPS后血压/mmHg B血压下降率/%(A-B)/A*△△

由表3可知，模型组动物注射LPS后，平均动脉压下降率超过20%，且下降率高于正常组 (P＜0.01)，可认为感染性休克模型复制成功。四逆汤预防组及治疗组平均动脉压下降率均低于模型组(P＜0.01)，提示四逆汤对感染性休克大鼠有一定的保护作用。

2.3 病理组织学检查

2.3.1 组织蜡块制备及HE染色

前一实验中留取的肾上腺标本取材后置于10%甲醛溶液中固定24h后取出，水冲洗30min，梯度酒精脱水，浸蜡3h，即制成蜡块。切成4μm厚的切片烤干备用。将烤干备用的切片置于60℃烤箱烤热后于100%二甲苯中脱蜡25min;梯度酒精和蒸馏水水化后苏木精染色5～15min，温水冲洗5min蓝化，盐酸酒精分化，伊红复染5～20s;梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

2.3.2 结果

各组大鼠肾上腺病理切片观察，见图1～图8。

2.4 统计学处理

以上实验结果，计量资料数据以均数 (x)±标准差 (s)表示，数据符合正态分布、方差齐的数据进行方差分析;计量资料不符合正态分布，则用秩和检验;计数资料数据进行χ2检验，或者用Fisher精确概率法;等级资料用秩和检验。

3 讨论

近年来对中药四性的基础研究表明，温热药有增强HPA轴的作用。沈自尹院士在对肾本质的研究中证实:肾阳虚的病理改变主要在下丘脑，温补肾阳的药物可直接作用于下丘脑，提高促CRH的表达水平，调节下丘脑-垂体-肾上腺-胸腺轴的受抑状态。基于四逆汤所主治病症与感染性休克之间的相似之处及其在临床上所表现出的抗休克作用，温热药对HPA轴受抑制模型大鼠的肾上腺皮质轴的异常变化具有良好的纠正作用和我们前期实验结果，我们认为:四逆汤主要通过改善于感染性休克时受抑制的HPA轴功能而发挥抗休克作用。本研究通过复制了HPA轴抑制动物模型和HPA轴抑制大鼠感染性休克模型，考察四逆汤对该模型HPA轴的影响。

正常情况下，CORT分泌的增加是ACTH刺激的结果，在皮质酮所致HPA轴抑制的状态下，血中较高水平的皮质酮可对ACTH的分泌产生负反馈抑制，导致 ACTH分泌减少，模型组 CORT、ACTH含量比正常组降低 (P＜0.05)，CORT、ACTH分泌减少，说明大鼠HPA轴抑制，皮质酮致HPA轴抑制大鼠模型复制成功。给予高低剂量的四逆汤后，能够对抗HPA轴的抑制状态，高剂量组大鼠血清CORT、ACTH含量均升高，低剂量组大鼠血清CORT含量也显著升高，ACTH虽也有所升高，但差异无统计学意义。四逆汤改善HPA轴抑制状态的机理还有待进一步研究。

图1、图2正常组肾上腺，HE染色，10×40，被膜由薄层结缔组织构成，无皱缩。球状带细胞较小，锥形，细胞聚集成球团状。束状带细胞较大，多边形，胞质内含脂滴空泡。

图3、图4皮质酮致HPA轴抑制大鼠模型组肾上腺，HE染色，10×40，被膜皱缩，球状带细胞、束状带细胞体积缩小、数目减少，胞质内脂滴空泡增多。

图5 高剂量组肾上腺

图5、图6四逆汤预防给药高剂量组对皮质酮致HPA轴抑制大鼠模型肾上腺的影响，HE染色，10×40，被膜皱缩、球状带细胞、束状带细胞体积缩小、数目减少、胞质内脂滴空泡增多的现象较模型组减轻。

图7、图8四逆汤预防给药低剂量组对皮质酮致HPA轴抑制大鼠模型肾上腺的影响，HE染色，10×40，被膜皱缩、球状带细胞、束状带细胞体积缩小、数目减少、胞质内脂滴空泡增多的现象较模型组减轻。

实验中模型组肾上腺指数在皮质酮造模之后降低，提示长时间给予外源性糖皮质激素使肾上腺萎缩;文献报道［10］皮质酮应用能诱导大鼠肾上腺皮质束状带细胞的大量调亡，减少球状带细胞的增殖和迁移，束状带和网状带细胞体积变小，皮质酮造成肾上腺皮质萎缩可能与上述因素均有关系。四逆汤高剂量组与正常组肾上腺指数比较，减少不明显，并明显高于模型组，提示四逆汤高剂量能减轻皮质酮致HPA轴抑制大鼠肾上腺萎缩。四逆汤低剂量组肾上腺指数也高于模型组，虽然统计学上差异无显著性意义，但出表现出减轻肾上腺萎缩的趋势。组织病理学结果 (图1～图8)也表明:四逆汤高、低剂量组能改善肾上腺被膜皱缩状态，使球状带细胞、束状带细胞体积较模型组增大、数目增加。由上可见，四逆汤可从多方面干预皮质酮对肾上腺皮质的损害或抑制，表现出对抗皮质酮所致的大鼠HPA轴抑制。

在皮质酮致HPA轴抑制大鼠模型复制成功的基础上，给动物腹腔注射LPS复制HPA轴抑制大鼠感染性休克模型，为全面了解四逆汤的作用，增加了四逆汤预防给药组。结果，四逆汤预防组及治疗组平均动脉压下降率均少于模型组 (P＜0.01)，提示四逆汤对感染性休克大鼠有一定的保护作用。文献研究报道，四逆汤能显著改善内毒素性休克大鼠的微循环、抑制平均动脉压的降低［14］。四逆汤能改善血压、保持心率、减轻内毒素引起的血液浓缩、抑制中性粒细胞数增加的作用，并在不同程度上提高内毒素处理动物的存活率［15］。结合文献报道和本实验结果，我们认为四逆汤治疗感染性休克时，其作用靶点可能是在HPA轴。本实验用药是以炙甘草为君药的四逆汤，炙甘草用量较大，可以作为外源性糖皮质激素补充在感染性休克时HPA轴抑制所致的糖皮质激素相对不足。

本研究结果表明:四逆汤在感染中毒性休克伴肾上腺皮质功能不全时能纠正HPA轴的抑制状态，维持大鼠在应激状态下器官功能、内环境的稳定，从而对调节危重症应激反应和休克状态起重要治疗作用。

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