海篷子籽油制备共轭亚油酸及其组分分析

潘群文 陈美珍 吴 演

海篷子籽油制备共轭亚油酸及其组分分析

潘群文 陈美珍 吴 演

(汕头大学理学院生物学系，汕头 515063)

研究海篷子籽油中亚油酸转化制备共轭亚油酸的工艺条件。以海篷子籽油为原料，KOH为催化剂，乙二醇为溶剂，碱异构法转化共轭亚油酸。采用Box－Behnken试验设计，优选海篷子籽油共轭亚油酸的最佳制备技术条件。结果表明海篷子籽油是制备共轭亚油酸的良好原料，所得产品中共轭亚油酸质量分数达87%以上，共轭亚油酸两种活性异构体9c，11t－CLA和10t，12c－CLA质量分数达68%以上。用海篷子籽油制备共轭亚油酸最适条件为:反应温度在180℃，反应时间3．9 h，溶剂用量为油质量的2倍，催化剂用量为籽油质量的25%。本研究所优选的工艺条件可使籽油中亚油酸转化率高达94．6%，所制得的海篷子共轭亚油酸产品的各项理化指标接近食用油标准，工艺条件实际可行，制备的共轭亚油酸产品安全无毒，有望开发成一种高附加值的保健食用油。

海篷子 亚油酸 共轭亚油酸 气相色谱 碱异构化

共轭亚油酸(Conjugated Linolei Acid，CLA)，是必需脂肪酸亚油酸衍生的共轭双烯的多种位置与空间异构体的总称［1］，主要有 9c，11t、10t，12c、9t，11c和 9t，11t等［2］，其中 9c，11t－ CLA 和 10t，12c － CLA被证实具有生理活性［3－4］。CLA在230～233 nm 处有最大吸收峰，而亚油酸没有［5］。天然存在的CLA不多，目前主要是利用亚油酸碱催化共轭化反应或酶催化异构化反应转化获得［6－8］。共轭亚油酸是一种新发现的营养素，具有显著的抗肿瘤、降低人体血脂水平和脂肪含量、抗动脉粥样硬化、增加肌肉、提高免疫力、合成前列腺素和防治糖尿病等多种重要的生理功能［9］。CLA食品补充剂近期已在美国上市，是美国食品学会推荐的流行补充剂之一。我国2009年已经将共轭亚油酸批准为功能食品，CLA的应用越来越广泛。

海篷子是近年从北美引进的海水蔬菜，目前在我国南方沿海滩涂正在大规模栽培，其种子含油量高达33%，籽油中亚油酸质量分数达73．52%，适宜作为制备CLA的原料，因此本研究以海篷子籽油为原料，碱异构法转化共轭亚油酸，采用Box－Behnken试验设计，优选海篷子籽油共轭亚油酸的最佳制备技术条件，以期为海篷子的开发利用提供技术支持。

1 材料与方法

1．1 原料与试剂

海篷子籽油:汕头大学食品生物技术实验室提供，亚油酸质量分数经气相色谱测定73．52%;三氟化硼甲醇溶液(化学纯):上海化学试剂公司;正己烷(色谱纯):广州市西陇化工试剂有限公司，亚油酸甲酯、共轭亚油酸甲酯(9c，11t－ CLA、10t，12c－ CLA 混合样)(色谱纯):NU－CHEK。

1．2 仪器和设备

UV－2100型紫外分光光度计:龙尼柯仪器有限公司;OSB－2100型旋转蒸发仪:上海爱朗仪器有限公司;HL－5多功能搅拌器:常州国华电器有限公司;GC－17A气相色谱仪:日本岛津有限公司。

1．3 试验方法

1．3．1 油脂的共轭化

取40 g乙二醇，置于烧瓶中，加入5 g催化剂加热溶解，称取20 g海篷子籽油加入上述溶液中，分别于一定温度下反应4 h。反应温度降至80℃时，经酸中和，蒸馏水洗至中性后，再用无水硫酸钠干燥，制得含CLA的混合脂肪酸。

共轭转化率计算为:CLA/LA×100%

式中:CLA为产品中共轭亚油酸含量;LA为籽油中亚油酸含量。

共轭亚油酸产品相关理化指标测定 过氧化值按照GB/T5538—2005测定、皂化价按照GB/T 5534—2008测定、碘价按照GB/T 5532—2008测定。

1．3．2 共轭亚油酸的检测方法

紫外分光光度法［10］:取催化反应所得海篷子共轭化油0．1 g于10 mL试管中，用正己烷稀释到5 mL，摇匀，移取5μL于10 mL试管中，振荡摇匀备用，采用紫外分光光度计法，以纯正己烷作参比，在190～300 nm处进行全波段扫描，查看在231～233 nm间是否有最大吸收峰，如果有最大吸收峰出现，证明亚油酸已经转变为共轭亚油酸。

1．3．3 共轭亚油酸组分分析

采用气相色谱分析。

1．3．3．1 气相色谱分析条件

检测器为FID。色谱柱:DB－WAX(20 m×0．25 mm，0．25 μm);升温程序:140 ℃ 保持 4 min，以30℃/min升至230℃，保持10 min;载气(N2)流速1．26 mL/min，压力 127 kPa，进样量 1 μL;分流比1∶30。

1．3．3．2 脂肪酸甲酯制备方法［11］

取30 mg脂肪酸放入10 mL具塞试管中，在试管中加入2 mL氢氧化钠甲醇溶液，充氮气。在振荡器上振荡，混匀，置于60℃水浴中振荡15～30 min(约5 min取出振荡)，至油滴消失，趁热在试管中加入2 mL 14%三氟化硼甲醇溶液，充氮气，漩涡振荡，混匀，继续在水浴中振荡2 min，趁热加入2 mL正己烷，充氮气封口，漩涡振荡混匀，继续在水浴中振荡1 min，放置于室温冷却，加入少量饱和氯化钠水溶液，边加边轻微振荡，继续加到接近管口，静置大约15 min使之分层，小心吸取上清液直接用于气相色谱测定。

1．4 试验设计与数据处理

本研究采用Box－Behnken试验设计，选取反应温度、反应时间、溶剂及KOH用量作为响应面分析的4个因素，在单因素试验的基础上，采用Box－Behnken试验设计对催化反应的温度、时间、催化剂用量和溶剂用量做进一步优化，分别以X1、X2、X3和X4代表，每个自变量的低、中、高试验水平分别以－1、0、1进行编码(如表1所示)。

表1 碱性异构共轭亚油酸因素和水平表

2 结果与分析

2．1 紫外光谱分析跟踪共轭化反应效果

控制反应温度180℃、反应时间3 h不变，逐步增加催化剂用量占籽油质量从5%～25%进行碱异构化催化反应，以正己烷为参比，不同催化剂用量处理下产物的正己烷溶液的紫外吸收光谱图如图1。

图1表明原料在200 nm处有比较大的吸收峰，随着催化剂用量的增加，原料峰逐渐减弱，而在231 nm处产物吸收峰不断增强，该峰是共轭亚油酸的特征吸收峰。表明海篷子籽油中亚油酸共轭异构化生成共轭亚油酸。

其次，要作一点具体的指导。如怎样划分文章层次？怎样归纳中心思想？怎样分析写作特点等，我均根据《魏书生文选》第一卷介绍给学生。另如质疑，我既教他们怎样从课文内容、形式乃至字、词、标点等各角度设疑，又以往届生设的佳题来引路，尤其鼓励学生在无疑处设疑。即如字词，虽似抄抄，但我强调：筛选的过程、筛选的好不好，也看得出你的语文水平、作业态度。初一新生有很强的表现欲，他们自会一丝不苟。

图1 紫外光谱分析跟踪共轭化反应进程

2．2 响应面分析法优化海篷子籽油共轭化催化反应工艺条件

2．2．1 反应影响因素的选取以及分析方案

在综合考察了反应时间、反应温度等单因素试验对共轭化催化反应的影响后，根据相应试验表进行试验后，对数据进行二次回归拟合，得到包括一次项、二次项、交互项的二次方程，分析各因素的主效应和交互效应，最后在一定水平范围内求取最佳值，试验方案及结果见表2。

表2 Box－Behnken设计方案及海篷子籽油共轭化率的试验值

续表

2．2．2 模型方程的建立与显著性检验

利用minitab13统计软件，通过表2中海篷子籽油碱异构化反应试验数据进行多元回归拟合，获得海篷子籽油共轭化率对编码自变量反应温度、反应时间、催化剂用量和溶剂用量的二次多项回归。

2．2．3 响应面分析方案及结果

根据试验结果建立的数学模型为:

式中:Y为共轭化率/%;X1为反应温度/℃;X2为反应时间/h;X3为m(KOH):m(油);X4为m(溶剂):m(油)。

表3的方差分析表明，该回归方程显著(P=0．002)。R2=91．5%，表明响应值共轭化率(Y)实际值与预测值之间具有较好的拟合度，因此该模型可用于预测响应值海篷子籽油共轭化率(Y)的实际情况。由回归方程系数显著性检验(表4)可知，因素X1对共轭化率(Y)线性效应高度显著，因素X3对共轭化率(Y)线性效应比较显著，而因素X2、X4对共轭化率率(Y)线性效应不显著，因此影响籽油共轭化率的个因素主次排列依次是:温度＞催油比＞反应时间＞溶油比;因素X21、X22和 X24对海篷子籽油共轭化率(Y)曲面效应不显著;因素 X1X2、X1X3、X2X3、X2X4、X3X4对共轭化率(Y)交互效应不显著，而 X1X4对共轭化率(Y)交互效应较显著，因此各具体试验因子对响应值的影响不是简单的线性关系。

表3 方差分析表

表4 回归方程系数显著性检验

对拟合方程求偏导，可以得到模型的最大值，即当反应温度为180℃，反应时间3．9 h，m(KOH):m(海篷子籽油)=0．254，m(乙二醇):m(海篷子籽油)=2∶1时，其理论共轭化率达到97．5%。

2．2．4 验证试验

表5 验证试验结果

在上述优化的催化反应条件下(即当反应温度为180 ℃，反应时间3．9 h，m(海篷子籽油)=0．254，m(乙二醇):m(海篷子籽油=2∶1时)进行3组平行试验，所得结果如表5所示。回归方程所得的预测值97．5%与验证试验的平均值94．6%的误差为2．97%，在误差允许范围内(20%)说明回归方程能较真实地反映各筛选因素对共轭化率的影响，证明应用响应面法在提高海篷子籽油共轭化率的回归模型可靠。

2．3 海篷子籽油及其CLA产品的气相色谱分析

将海篷子籽油及在反应温度为180℃，反应时间3．9 h，m(KOH):m(海篷子籽油)=0．254，m(乙二醇):m(海篷子籽油)=2∶1条件下所得的CLA产品甲酯化后，经气相色谱分析，海篷子籽油、亚油酸标样、CLA标样及制备的CLA产品的气相色谱图见图2。

图2 不同种油的气相色谱图

由图2可知，海篷子籽油中亚油酸质量分数达73．52%，在最佳反应条件即反应温度为180℃，反应时间3．9 h，m(KOH):m(海篷子籽油)=0．254，m(乙二醇):m(海篷子籽油)=2∶1条件下所得的CLA产品与标样比较可知，15．798 min和16．135 min的色谱峰是共轭亚油酸的活性成分(9c，11t－CLA;10t，12c－CLA)，活性成分质量分数达68%以上，亚油酸共轭化率达93．4%，同时海篷子共轭亚油酸气相色谱中出现其他的色谱峰推测其为软脂酸、硬脂酸以及油酸等。而比对图2a、图2c可知在13．775 min出现亚油酸色谱峰，亚油酸质量分数达73．52%。

2．4 共轭亚油酸的理化指标分析

对共轭化催化反应后所得的CLA产品进行理化指标的分析，各指标均按国家标准进行试验分析。分析结果见表6。

表6 CLA产品理化指标分析结果

从表6可以看出，海篷子籽油CLA产品碘价、皂化价略低于共轭亚油酸酯产品项目指标，而酸价略偏高，推断可能是因为碱催化反应后所得产物油酯经过酸解后，由于酸有残留所致。

3 结论

利用Minitab13软件，通过响应面试验(Box－Behnken)方法对海篷子籽油共轭化催化反应进行优化，并利用统计学方法对该模型进行了显著性检验，优化了内在因素水平，探讨了各因素间的交互作用，并对试验结果进行数学模拟和预测。本研究以乙二醇作为溶剂体系进行海篷子籽油合成CLA的反应，解决了很多研究以丙三醇为溶剂导致共轭化率低的问题，推断可能因为丙三醇较为黏稠阻碍碱异构催化反应的顺利进行，影响异构反应中甘油酯的水解以及双键的移动。优化后得到的最佳反应条件即反应温度为180℃，反应时间3．9 h，m(KOH):m(海篷子籽油)=0．254，m(乙二醇):m(海篷子籽油)=2∶1，该条件下共轭化率达到94．6%。

CLA产品经气相色谱分析所得色谱图与标准品色谱图比对得到CLA产品在15．798 min和16．135 min的色谱峰是共轭亚油酸的活性成分(9c，11t－CLA，10t，12c－ CLA)，活性成分质量分数达 68% 以上，共轭亚油酸质量分数达87%以上。通过对CLA产品的理化指标的分析，我们得到CLA产品的理化指标接近食用共轭亚油酸酯的标准。因此该法所得产品安全，工艺可行。然产品在分离纯化过程中经酸化，水洗步骤伴有共轭亚油酸的损失。因此，为了提高CLA产品的得率，有必要对CLA的分离纯化工艺做进一步的优化。

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Study on the Preparation of Conjugated Linoleic Acid with Salicornia herbacea Seed Oil and the Analysis of Composition

Pan Qunwen Chen Meizheng Wu Yan
(Department of Biology，Shantou University，Shantou 515063)

Study the synthesis Tech－nology conditions of the Salicornia herbacea seed oil．Make the Salicornia herbacea seed oil as raw materials，KOH as catalyst，glycol as solvent，alkali isomerization method transformation of conjugated linoleic acid，using Box － Behnken experimental design，obtained the best preparation Tech－nology conditions Salicornia herbacea conjugate of seed oil the best preparation Tech－nology condition．Results show the Salicornia herbacea seed oil were good material on synthesis conjugated linoleic acids，the product of conjugated linoleic acid content over 87%with two kinds of activity isomers of conjugated linoleic acid content more than 68%．Optimal conditions were:temperature of 190℃，time of 3．9h，catalyst amount to oilas 25%and amount of solvent to oil in 2 times．The optimum conditions this research can make the conversion percent of the linoleic acid up to 94．6%．The physics＆ chemistry indexes of the CLA close to edible food standard and the process conditions are practical，is expected to develop into a kind of healthy cooking oil．

Salicornia herbacea，linoleic acid，conjugated linoleic acid，gas chromatograph，alkali isomerization

Q547

A

1003－0174(2012)02－0042－05

省部产学研合作专项资金项目(2010B090400461)

2011－05－03

潘群文，男，1985年出生，硕士，食品生物技术

陈美珍，女，1956年出生，教授，天然活性物质研究与开发