五种国产与进口小鼠病毒ELISA抗体检测试剂盒的比较研究

王 吉，卫 礼，付 瑞，李晓波，岳秉飞，贺争鸣

(中国食品药品检定研究院实验动物资源研究所，国家实验动物质量检测中心，北京 100050)

国家标准规定，实验小鼠病毒抗体检测方法主要有酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫酶试验(IEA)、免疫荧光试验(IFA)、血凝试验(HA)、血凝抑制试验(HAI)、免疫组织化学试验(IH)。但实验室通常采取ELISA法作为主要检测手段。作为国家实验动物质量检测中心，在承担来自全国各省市送检实验动物质量检测任务的同时，还为实验动物相关单位提供实验动物病毒ELISA抗体检测试剂盒。为提高ELISA法检测的准确性及可靠性，保证ELISA抗体检测试剂盒的质量，我们制备的淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、小鼠肝炎病毒(MHV)、仙台病毒(SV)、腺病毒(MAV)、小鼠细小病毒(MPV)等5种病毒ELISA抗体检测试剂盒与美国Charles River公司生产的试剂盒进行比较，客观评价和分析了国产试剂与进口试剂的真实性及可靠性。

1 材料和方法

1.1 材料

国产小鼠淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、肝炎病毒(MHV)、仙台病毒(SV)、腺病毒(MAV)、细小(MPV)病毒 ELISA抗体检测试剂盒(批 号 分 别 为 090122、090129、090206、090207、090212):本室生产;进口淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、小鼠肝炎病毒(MHV)、仙台病毒(SV)、腺病毒(MAV)、小鼠细小病毒(MPV)ELISA抗体检测试剂盒(批号分别为:LCM:His3(102808)T、MHV:17(070908)T、SV:Q(012808)P、MadV:F-10(11280F)Q、MPV:302(072808)U):美国 Charles River产品;小鼠血清:2010年国内送检的24份阴性血清和12份阳性血清。

1.2 主要仪器

酶标仪:Thermo Multiskan MK3;37℃水浴箱:上海森信实验仪器有限公司 DK-4500B型;37℃培养箱:WGP-600。

1.3 方法

1.3.1 实验操作及判断标准的确定:

1.3.1.1 实验操作依据各自试剂盒说明书进行。

1.3.1.2 判断标准

(1)国产试剂盒:在阴、阳对照成立的情况下:待检血清特异抗原孔A值≥0.2;待检血清特异抗原孔A值/阴性对照特异抗原孔A值≥2.1;特异抗原孔和正常抗原孔A值比值≥2.0时，判为阳性［1］。

(2)进口试剂盒:在阴阳对照成立的情况下(阴性对照特异抗原孔＜0.13，阳性对照特异抗原孔＞0.26):特异抗原孔和正常抗原对照孔A值均＜0.13，判为阴性;特异抗原孔和正常抗原对照孔A值均 ＞0.26，判为阳性;特异抗原孔 A值 ＞0.26，正常抗原对照孔A值 ＜0.26，用特异抗原孔A值减去正常抗原对照孔A值的差≥0.39时，判为阳性。

1.3.2 敏感性试验:两种试剂盒分别检测国产、进口阳性血清。血清从1:40依次倍比稀释到1:81920，进行检测。按照2种试剂盒的判断标准，最大稀释比例的阳性孔为其检测灵敏度［1，2］。

1.3.3 特异性试验:用5种试剂盒分别检测国内和国外其他4种阳性血清，同时设阴、阳对照。观察每种试剂盒与其他4种病毒有无交叉反应［2］。

1.3.4 精密性试验:同一批次试剂盒，测同一份阳性血清，同一稀释度同时做20孔，计算检测结果的批内变异系数［1］。

1.3.5 稳定性试验:将同一批次抗原包被板于4℃放置30、90、180 d，同时检测已知4份阴性和4份阳性血清，计算试剂盒检测数值结果的变化率(相对偏差)，比较试剂盒的时间稳定性［1，2］。

1.3.6 可信度:分别用国产和进口 LCMV、MHV、SV、MAV、MPV抗体 ELISA检测试剂盒，检测已经用商品化 LCMV、MHV、SV、MAV、MPV IFA 抗体检测试剂盒检测过的各自相对应的已知24份阴性血清和12份阳血清，验证国产和进口ELISA试剂盒的可信度［1－4］。

1.3.7 统计方法:对实验数据用SPSS11.5统计软件进行卡方(χ2)检验，P＜0.05为差异显著，P＜0.01 为差异极显著，均具有统计学意义［5，6］。

2 结果

2.1 敏感性试验

(1)国产和进口试剂盒检测国产阳性血清

表1 敏感性实验检测结果1Tab．1 Results of detection sensitivity obtained with the domestic and imported ELISA kits．I．

从表1检测结果看，国产和进口的MHV和SV试剂盒检测灵敏度均很高，国产试剂盒是进口试剂盒的2倍，差异显著(，P＜0.05);LCMV和 MPV检测灵敏度国产试剂盒均是进口试剂盒的的8倍，差异极显著(P＜0.01);MAV检测灵敏度进口试剂盒是国产试剂盒的16倍，差异极显著(P＜0.01)。

(2)国产和进口试剂盒同时检测进口强阳性血清

表2 敏感性实验检测结果2Tab．2 Results of detection sensitivity obtained with the domestic and imported ELISA kits．II．

从表2检测结果看，LCM、MPV试剂盒检测灵敏度相同，均为1:80;国产和进口 MHV和 SV试剂盒检测灵敏度均较高，进口试剂盒是国产试剂盒的2倍，差异显著(P＜0.05);进口 MAV试剂盒检测灵敏度是国产的16倍，差异极显著(P＜0.01)。

2.2 特异性试验

每种试剂盒分别检测国内、国外其他5种病毒阳性血清，在阴、阳性对照均成立的情况下，对其他4种病毒阳性血清检测，结果均为阴性，说明每种试剂盒与其他4种病毒均无交叉反应。

2.3 精密性试验

国内外五种试剂盒精密性试验结果(批内平均变异系数%)见表3。

表3 精密性试验结果(批内变异系数%)Tab．3 Results of detection precision obtained with the domestic and imported ELISA kits(coefficient variations%)

国内外5种试剂盒精密性试验检测结果显示均小于10%。

2.4 稳定性试验

稳定性试验检测结果见表4。

表4 稳定性试验结果(相对偏差%)Tab．4 Results of detection stability obtained with the domestic and imported ELISA kits(Relative deviation，%)

稳定性试验结果显示五种国产试剂盒和进口试剂盒，测得的相对应的8份血清的 A值变化率(相对偏差)均小于25%。

2.5 可信度

每种病毒抗体的24份阴性血清，使用国产和进口试剂盒检测符合率均为100%，LCMV、MHV、SV、MPV 4种病毒抗体的12份阳性血清，使用国产和进口试剂盒检测符合率均为100%，仅有国产MAV试剂盒检测已知12份阳性血清，检测符合率为86.1%(表 5)。

表5 ELISA方法检测已知LCMV抗体阴、阳血清结果Tab．5 Detection results of known negative and positive sera samples with the domestic and imported ELISA kits

3 讨论

敏感性试验显示，LCMV和MPV国产试剂盒检测国产和进口阳性对照血清灵敏度分别为1∶640和1∶80，进口试剂盒检测国产和进口阳性对照血清灵敏度均为1:80，说明 LCMV、MPV国产试剂盒检测敏感性不比进口试剂盒低。MHV、SV国产与进口试剂盒检测国内阳性血清显示灵敏度均很高(均达到1:2560以上)，且国产试剂盒高于进口试剂盒2倍;国产与进口试剂盒检测进口阳性血清显示灵敏度均较高(均达到1:320以上)，且进口试剂盒高于国产试剂盒2倍，说明国产MHV、SV试剂盒检测敏感性与进口MHV、SV试剂盒检测敏感性均较好，同时也说明了国产和进口试剂盒抗体检测水平相当［4，7］。

国产MAV试剂盒检测国产和进口试剂盒阳性血清，灵敏度均很低，分别为 1∶80和 1∶40，且检测国产阳性对照血清 A值最高只有0.461，检测进口阳性对照血清，A值最高只有0.304。而用进口试剂盒检测国产和进口试剂盒的阳性对照血清灵敏度均达到1:1280，且检测的 A值均很高，进口试剂盒检测国内MAV阳性对照血清A值最高达到1.153，进口试剂盒检测进口阳性对照血清最高达到0.972。这说明我们的试剂盒抗原包被板抗原性很低，导致抗原抗体结合反应能力降低，使试剂盒检测敏感性下降，即抗体检测水平下降［4，7］。同时通过此次试剂盒比对实验也使我们找到了近2年来检测过程中发现MAV阳性对照血清A值下降的原因。国产试剂盒用的检测抗原是经过蔗糖梯度纯化的全病毒抗原，而病毒是用细胞来进行传代培养，也就是我们在传代培养MAV过程中，可能是由于细胞毒性导致了培养细胞病变，误认为是病毒导致细胞病变，而且一代一代传下去，而导致病毒抗原性下降。本实验室通过分子生物学检测也证实了这一点。用PCR方法对本室传代的MAV进行检测时，检测结果为阴性，而用同一PCR方法检测从美国ATCC新购的MAV(编号VR-550)传代培养的P3代细胞毒，检测结果为阳性。

但MAV试剂盒的阳性对照血清抗体效价很高，可能与检测用抗原(批号:080624)和免疫用抗原(批号:030322)不是同一批号有关，且通过此实验证明国产MAV试剂盒阳性对照血清抗体效价还很高，说明当时用于制备抗血清用的免疫用抗原(批号:080624)的抗原性还没有下降，而用于检测用包被抗原(批号:080624)抗原性已经下降。

在试剂盒显色剂使用方面，进口试剂盒使用ABTS(2，2'-连氮-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)，国产试剂盒使用 OPD作为 ELISA显色剂，虽然敏感、特异，但由于OPD(邻苯二胺)具有挥发和致突变效应，所以国内试剂盒显色剂需要进行改进。

通过此次比对实验不但使我们找到了国产MAV试剂检测盒敏感性下降的原因，也提示我们，实验室原有的病毒传代培养方式，可能有的病毒不能适应，所以为了保证和提高检测试剂的质量，有些病毒的传代培养方式需要更新或改变。同时也说明除 MAV试剂盒外，与进口试剂盒比，国产LCM、MHV、SV、MPV试剂盒在敏感性、特异性、精密性、稳定性及可信度方面均较好，而且通过在2010和2011年“实验动物质量检测机构比对实验”中，用国产小鼠肝炎(MHV)、小鼠仙台(SV)ELISA抗体检测试剂盒的进行不同人员及不同实验室的比对实验，也证明了国产小鼠肝炎(MHV)、小鼠仙台(SV)ELISA抗体检测试剂盒的质量可靠，稳定性、重复性、准确性均较好。

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