仙台病毒RT-PCR检测方法的建立及灰仓鼠中流行情况调查

李晓波，付 瑞，王 吉，卫 礼，邢 进，冯育芳，岳秉飞，贺争鸣

(中国食品药品检定研究院实验动物资源研究所，北京 100050)

仙台病毒属于副粘病毒科，副粘病毒属，核酸型为单股负链 RNA，基因组全长 15 384 bp［1］，编码6 个结构蛋白(L，P，NP，HN，F，M)和一个非结构蛋白C，其基因排序次序为:3'-Leader-NP-P+C-M-FHN-L-Leader-5'［2］。仙台病毒传染性强，容易扩散，是啮齿类实验动物最难控制的病毒之一。啮齿类实验动物感染SeV会对其免疫系统、致瘤作用及繁殖等产生影响，从而影响实验结果［3］，动物一旦感染很难清除，严重影响幼鼠生长发育并降低成年鼠的繁殖率［4］。

现有的实验动物种属和品系已越来越不能满足科学快速发展的要求，迫切需要开发更多适应不同要求的新型实验动物，灰仓鼠(Cricetulus migratorius)就是在包虫病研究中筛选出来的一种鼠类。灰仓鼠属于啮齿目，仓鼠科，仓鼠亚科，仓鼠属。广泛分布于中亚地区，栖息生境从荒漠平原至海拔3 000 m以上的高山草甸均有分布。已查明该鼠在自然界参与土拉伦、森林脑炎、鼠疫等多种自然疫源性疾病传播［5，6］，并且对仙台病毒易感。目前我国还没有关于灰仓鼠仙台病毒感染的报道，也没有可用于灰仓鼠SV的检测方法。我们针对仙台病毒L基因设计引物，建立了仙台病毒 RT-PCR检测方法，并对60只采自我国新疆地区的灰仓鼠，进行SV感染的检测。

1 材料

1.1 试剂

AMV逆转录酶、随机引物购自 Promega公司;RNA酶抑制剂购自庄盟公司;Taq Hs DNA酶、dNTP、100 bp DNA marker购自宝生物工程(大连)有限公司，RNA提取试剂盒购自Qiagen公司。

1.2 病毒毒株及疫苗

仙台病毒、猴副流感病毒(SV5)、犬瘟热病毒、小鼠肺炎病毒、呼肠孤病毒III型均为本实验室保存。腮腺炎病毒减毒活疫苗来自本院病毒一室。SPF鸡胚购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。

1.3 灰仓鼠

由新疆地方病防治研究所提供。普通级环境饲养，60只，成年，体重在(40～50)g之间，雌雄各半。

2 方法

2.1 病毒的培养

用8～13日龄的鸡胚，SeV毒种接种绒毛尿囊腔，接种后第4天收获尿囊液，冻－70℃备用。

2.2 RNA的提取

取0.5 mL上述上清液按试剂盒的操作说明提取RNA，最后用40 μL去RNA酶的无菌水溶解。

2.3 RT-PCR方法建立

2.3.1 逆转录:25 μL反应体系中含5×RT buffer 5 μL，d NTP(2.5 mmol/L)4 μL，随机引物(500 μg/mL)1 μL，AMV(10 U/μL)0.5 μL，RNA 酶抑制剂(40 U/μL)0.5 μL，病毒 RNA 8 μL，反应条件:37℃90 min，72℃ 15 min，4℃ 5 min。

2.3.2 PCR引物设计:参照NCBI发表的仙台病毒(gi:9627219)基因组序列设计引物，引物信息见表1，由生工生物工程(上海)有限公司合成，使用时用灭菌超纯水稀释为10 μM，PCR产物长度为197 bp。

表1 SeV RT-PCR引物Tab．1 Primers for the SeV RT-PCR

2.3.3 PCR扩增:反应体系包括，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP(2.5 mmol/L)2 μL，引物(10 μmol/L)各 1μL，cDNA 2 μL，Taq Hs酶(5 U/μL)0.5 μL，灭菌 dH2O 16 μL。反应条件:94℃ 变性 45 s，56℃ 退火45 s，72℃延伸30 s，共35个循环，最后72℃延伸7 min。

2.4 RT-PCR方法的验证

2.4.1 敏感性:紫外分光法测定SV cDNA浓度，将cDNA10倍系列稀释后进行PCR扩增，测定方法的最大检出限。

2.4.2 特异性:分别提取小鼠肺炎病毒、呼肠孤病毒III型、猴副流感病毒、腮腺炎病毒、犬瘟热病毒、正常鸡胚尿囊液及小鼠肺脏组织 RNA，用建立的RT-PCR法进行检测，测定方法的特异性。

2.5 灰仓鼠的检测

每一份样本按以下方法处理:取灰仓鼠肺脏约100 mg，加入900 μL 灭菌 PBS，匀浆后12 000 r/min 离心10 min，上清液用0.2 μm 滤膜过滤，取400 μL 过滤后的上清，用Qiagen公司的RNA提取试剂盒提取RNA。

3 结果

3.1 RT-PCR结果及测序

3.1.1 RT-PCR结果:SeV毒株提取RNA后经RTPCR扩增，2%琼脂糖电泳，可见在197 bp处有预期的目标条带(图1)。

3.1.2 RT-PCR产物测序:PCR产物直接送上海生工公司测序，测序结果与NCBI数据库比对，与SeV(dbj∣ AB275416.1∣)相应序列符合率达98%(图 2)。

3.2 灵敏性测定

紫外分光光度法测得SeV cDNA的浓度为968.6 μg/mL，将 cDNA 进行 10－1～10－6稀释，随后进行PCR扩增，由图3可见，在10－4稀释的时候仍可见目的条带，说明本研究建立的PCR技术方法能检测的SV cDNA最低浓度是96.8 ng/mL。

图1 SeV毒种RT-PCR扩增Fig．1 RT-PCR amplification for SeV．

图2 SeV毒种RT-PCR产物测序比对结果Fig．2 The BLAST results of sequencing of SeV RT-PCR products．

3.3 特异性测定

分别以小鼠肺炎病毒、呼肠孤病毒III型、猴副流感病毒、腮腺炎病毒、犬瘟热病毒及正常的鸡胚尿囊液和小鼠肺脏组织为对照，用建立的PCR方法进行扩增。电泳结果表明:仅有SV毒株有197 bp的目的条带，而其他对照均没有任何条带(图4)，说明本方法有较好的特异性。

3.4 灰仓鼠中SV的检测

3.4.1 取灰仓鼠肺组织，提取总 RNA，采用 RTPCR方法进行检测，结果检测到2份样本阳性(图5只显示部分结果)，阳性率为3.33%(2/60)。

3.4.2 SeV阳性样本测序:阳性样本的 PCR产物送上海生工测序，测序结果与NCBI发表的SeV(gb∣DQ219803.1∣)基因组相应序列的符合率为98%，证实为仙台病毒感染(图6)。

图3 敏感性试验结果1:DNA marker 2～7:SeV cDNA 分别 10－1～10－6稀释 8:阴性对照Fig．3 The results of sensitivity test of the RT-PCR products．Lane 1:DNA marker;2～7:10－1～10－6 dilution of SeV cDNA;8:Negative control

图4 特异性试验结果Fig．4 Results of specificity test of the detection technique for Sendai virus．

图5 60份灰仓鼠样本部分检测结果1:仙台阳性对照 2～11:样本12:阴性对照 M:DNA markerFig．5 Some results of RT-PCR assay for sixty Cricetulus migratorius samples．Lane 1:SeV positive control;2～11:Samples;12:Negative control;M:DNA marker

4 讨论

图6 灰仓鼠SeV阳性样本测序比对结果Fig．6 The BLAST results of RT-PCR products sequencing of SeV-positive samples of Cricetulus migratorius．

本实验的灰仓鼠来自新疆地方病防治研究所，廖立夫教授等早在上世纪90年代就开始从事野生灰仓鼠的驯化繁殖工作，现在已经成功繁育出具有一定规模的动物种群［7］，虽然目前已有灰仓鼠用于各种实验研究的报道，但作为一种实验动物，其标准化程度还较低。

实验啮齿类动物是SV的自然宿主，自然条件下SV能感染小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠。灰仓鼠作为新的实验动物品种，迫切需要对其微生物携带情况进行调查，灰仓鼠与实验常用的地鼠同属仓鼠科，仓鼠属，实验动物国标将SV列为SPF地鼠的必检项目［8］，因此，我们对灰仓鼠中携带 SeV的情况进行了调查。

血清学调查显示仙台病毒在小鼠等啮齿类实验动物中感染率较高，但国内外还没有灰仓鼠中SV感染率调查的相关报道。病毒的分离鉴定是仙台病毒诊断的金标准，除鸡胚外，SV也可在BHK21或Vero细胞上进行增殖［3］，但病毒分离鉴定周期较长，费时费力;目前，国内主要采用ELISA方法检测动物血清中的SV抗体，ELISA虽然具有较高的敏感性，但需要纯度很高的纯化检测抗原，并不适用于检测乳鼠和免疫缺陷动物，同时对抗体的检测不能反应当前病毒的感染情况。PCR技术作为分子生物学检测的重要方法，具有快速、敏感、简便等优点，国内外已有 SV RT-PCR检测方法的相关报道［9－11］。与之相比，我们建立的 SV RT-PCR 检测方法具有更好的特异性和敏感性(结果未显示)，适用于对动物当前的病毒感染情况进行调查。

虽然本次检出的灰仓鼠SV感染率较低，阳性动物也无明显临床症状，但是该病毒可通过直接接触和空气传播的方式扩散，给整个种群SV感染的控制带来很大困难，需要引起我们的重视。本实验建立的SV RT-PCR检测方法，也为今后制定灰仓鼠质量标准提供了一定的基础数据。

致谢:感谢新疆地方病防治研究所廖立夫教授等对本课题的大力支持!

［1］ Itoh M，Isegawa Y，Hotta H，et al．Isolation of an avirulent mutant of Sendai virus with two amino acid mutations from a highly virulent field strain through adaptation to LLC-MK2 cells［J］．J Gen Virol，1997，78:3207 －3215．

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［4］ 吴惠英，卫礼，贺争鸣，等．不同方法检测鼠群Sendai抗体的研究［J］．北京实验动物科学，1989，6(1):12－16．

［5］ 廖立夫．灰仓鼠实验动物化研究［J］．中国实验动物学杂志，2002，12(3):183－185．

［6］ 王思博，杨赣源．新疆啮齿动物志［M］．乌鲁木齐:新疆卫生出版社．1982．165．

［7］ 廖立夫，黎唯．灰仓鼠的室内繁殖研究［J］．中国实验动物学报，1998，6(2):33－35．

［8］ 实验动物国家标准［S］．GB/T14926.23－2001

［9］ Hayase Y，Tobita K，Kii M，at al．Detection of nucleoprotein gene of Sendai virus in the lungs of rats by touchdown nested reverse transcriptase ploymerase chain reaction［J］．Exp Anim，1997，46(4):307－310．

［10］ Bootz F， Sieber I， Popovic D， etal． Comparison ofthe sensitivity of in vivo antibody production tests with in vitro PCR-based methods to detect infectious contamination of biological materials［J］．Lab Animals，2003，37(4):341－ 351．

［11］ 王宗耀，谢建云，邵伟娟，等．仙台病毒 RT-PCR检测方法的建立与应用［J］．中国比较医学杂志，2008，18(1):49－53．