HPLC法测定香菇中有机酸含量的检测技术研究

何旭孔，邢增涛，饶钦雄，赵晓燕*，赵明文

1上海市农业科学院农产品质量标准与检测技术研究所;2农业部食用菌产品质量监督检验测试中心，上海201403;3南京农业大学生命科学学院，南京210095

HPLC法测定香菇中有机酸含量的检测技术研究

何旭孔1，2，3，邢增涛1，2，饶钦雄1，2，赵晓燕1，2*，赵明文3

1上海市农业科学院农产品质量标准与检测技术研究所;2农业部食用菌产品质量监督检验测试中心，上海201403;3南京农业大学生命科学学院，南京210095

本实验建立了HPLC法同时测定香菇中酒石酸、苹果酸、乙酸和柠檬酸的方法。在酸提条件下，利用Agela Venusll MP C18色谱柱，以2%CH3OH-20 mM(NH4)2HPO4(pH 2.40)为流动相，流速为1.0 mL/min，柱温为35℃，检测波长为210 nm，进样量为10 μL。四种有机酸均在8 min内出峰。本法准确、可靠、快速、简便，检出限较低，适合于大批量样品的分析与检测。

HPLC;香菇;酸提;有机酸

有机酸广泛存在于各种农产品中，其种类和含量直接影响农产品口感、风味和色泽，也是农产品成熟度、加工性以及耐储藏性的重要依据［1］，因此测定食用菌中有机酸的种类和含量具有重要意义。目前测定有机酸的方法包括离子色谱法、高效液相色谱法［2，3］和气相色谱法。高效液相色谱法操作较简单［4］，对于不易衍生化的有机酸可以直接测定。

目前，采用HPLC测定各种植物及果汁中有机酸的报道较多［5，6］，而香菇中有机酸的分离与测定未见有报道。由于不同农产品含有不同的基质，提取有机酸的方法也不一样。因此，本研究优化有机酸的提取方法条件和色谱检测方法条件，以建立能快速、简便和高效的测定香菇中有机酸的方法。

1 材料与方法

1.1 样品采集

香菇(Lentinus edodes)样品:2011年6月采集于浙江省磐安县食药用菌研究所，将香菇切成薄片，60℃烘干，粉碎，储存于干燥器中备用。

1.2 仪器与试剂

高压液相色谱仪(Waters 2695 Separations Module，Waters)，Waters 2487紫外检测器(Waters)，纯水仪(PURELAB Ultra，ELGA)，电热恒温振荡水槽(DKZ-2型，上海精宏实验设备有限公司)，离心机(SORVALL Biofuge stratos)。

甲醇(色谱纯，Merck KgaA，Germany)，酒石酸(99.5%)、苹果酸(99.5%)、乙酸(99.7%)、一水柠檬酸(99.5%)标准品(D-86199 Augsburg，Germany)，盐酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)，乙醇(分析纯，阿拉丁试剂)。

1.3 标准溶液的配制

分别准确称取10 mg酒石酸、苹果酸、乙酸和柠檬酸标准品于10 mL容量瓶中，用超纯水溶解并准确定容至10 mL，制成有机酸标准溶液储备液(浓度为1.0 mg/mL)。再用超纯水将储备液稀释成浓度为1、5、10、50、100、150、200和250 mg/L的单标和混标工作溶液，待上样。

1.4 色谱条件优化

色谱条件:Agela Venusll MP C18色谱柱(4.6× 250 mm，5 μm);流动相:2%CH3OH-(NH4)2HPO4;柱温:35℃;流速:1.0 mL/min;进样量:10 μL;紫外检测波长:210 nm。对流动相中(NH4)2HPO4水溶液浓度(10、20、50 mM)及pH(2.40、2.60、2.80)条件进行优化，确定最佳的色谱条件。

1.5 样品前处理方法优化

1.5.1 提取溶剂的筛选

1.5.1.1 水提:准确称取香菇子实体粉末0.5 g，加入30 mL蒸馏水于50 mL离心管中，60℃水浴震荡提取30 min，冷却至室温。然后10000 rpm离心10 min，上清液经0.22 μm膜过滤至进样瓶，进行高效液相色谱测定［7］。按优化后的色谱条件进行分析。1.5.1.2 醇提:准确称取香菇子实体粉末0.5 g，加入30 mL 80%乙醇于50 mL离心管中，60℃水浴震荡提取30 min，冷却至室温。然后10000 rpm离心10 min，取10 mL上清液于小烧杯内，70℃水浴蒸发除去乙醇，残留物用流动相转入至刻度试管内，用流动相定容至10 mL，混匀，经0.22 μm膜过滤至进样瓶，进行高效液相色谱测定［1，8］。按优化后的色谱条件进行分析。

1.5.1.3 酸提:准确称取香菇子实体粉末0.5 g，加入0.1 mol/L HCl溶液于50 mL离心管中，60℃水浴震荡提取30 min，冷却至室温。然后10000 rpm离心10 min，上清液经0.22 μm膜过滤至进样瓶，进行高效液相色谱测定［9］。按优化后的色谱条件进行分析。

1.5.2 料液比的筛选

准确称取香菇子实体粉末0.1 g，分别加入5、10、15和20 mL 0.1 mol/L HCl溶液于50 mL离心管中，60℃水浴震荡提取60 min，冷却至室温。然后10000 rpm离心10 min，上清液经0.22 μm膜过滤至进样瓶，按优化后的色谱条件进行测定。

1.5.3 提取时间的优化

准确称取香菇子实体粉末0.1 g，加入15 mL 0.1 mol/L HCl溶液于50 mL离心管中，60℃水浴震荡分别提取15、30、45和60 min，冷却至室温。后续操作同1.5.2。

1.6 方法学考察

1.6.1 标准曲线的绘制

分别取浓度为1、5、10、50、100、150、200和250 mg/L的混标工作溶液，进行高效液相色谱分析，进样量为10 μL，以标准品浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线。

1.6.2 精密度实验

取200 mg/L的混标工作溶液，按优化后的色谱条件连续进样5次，测定峰面积，计算RSD。

1.6.3 重复性实验

取同一批香菇样品，按优化后的提取方法平行制备样品液5份，分别进样，测定各种有机酸含量，计算RSD。

1.6.4 稳定性实验

取新鲜配制的200 mg/L混标工作溶液，按优化后的色谱条件于0、5、10、15和20后分别进样，测定峰面积，计算RSD。

1.6.5 加样回收率实验

以香菇干样为基质，分别在不同水平下(见2.3.3)添加有机酸标准溶液储备液，按优化后的提取方法和色谱条件进行回收率试验。

1.7 香菇样品中有机酸含量的测定

准确称取香菇粉末0.1 g，按优化后的方法制备样品液，并按优化后的色谱条件进行分析。

2 结果与分析

2.1 色谱条件优化结果

利用Agela Venusll MP C18色谱柱，以20 mmol/ L磷酸二氢铵(pH 2.40)-甲醇(98∶2，V/V)为流动相，流速为1.0 mL/min，柱温为35℃时，酒石酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸的峰形与分离度较好。当磷酸二氢铵水溶液浓度为10 mmol/L时，四种有机酸的分离度相对较差，当磷酸二氢铵水溶液浓度为20和50 mmol/L时，四种有机酸的分离度均较好，但考虑到高浓度盐缓冲溶液影响柱子使用寿命，因此选用20 mmol/L磷酸二氢铵水溶液。另外磷酸二氢铵水溶液pH对四种有机酸的分离度和保留时间也有较大的影响。随着pH值升高，保留时间减少，分离度也变差。酒石酸保留时间最短，容易与样品中最先被洗脱下来的杂质混在一起而不能分开。因此选用较低的pH值，为2.40。

图1 有机酸标准样品色谱图Fig.1 Chromatogram of organic acids standards

2.2 样品处理方法优化

由于不同提取溶剂对香菇中不同物质具有不同的溶出作用。用蒸馏水和乙醇提取时，四种有机酸的提取效果并不是很好，容易受到杂质的干扰(图3和图4)。而用低浓度盐酸溶液提取时，各种有机酸受到杂质的干扰比较小(图2)。因此选用低浓度盐酸溶液作为提取溶剂。

不同料液比和提取时间均会影响香菇样品中有机酸的提取率。图5显示不同料液比对香菇中有机酸提取量的影响。但料液比为1∶100时，有机酸的提取量比较稳定，随着料液比的继续增加，有机酸含量无明显变化，因此料液比选为1∶100。图6显示提取时间对香菇中有机酸提取量的影响。可以看出，柠檬酸提取量受提取时间影响比较大。在15 min至60 min内，酒石酸、苹果酸、乙酸含量无明显变化，柠檬酸含量不断上升。综合各种有机酸的提取效率，选用60 min作为最佳的提取时间。

图5 料液比对有机酸含量的影响Fig.5 Effect of sample-solvent ratio on organic acids contents

图6 提取时间对有机酸含量的影响Fig.6 Effect of extraction time on organic acids contents

2.3 方法学考察

2.3.1 标准曲线

将系列浓度1～250 mg/L的有机酸混标工作溶液，在优化的色谱条件下测得峰面积，以峰面积对浓度作图，得到有机酸的工作曲线。以信噪比S/N=3所对应的浓度确定检测下限。线性回归方程和检测限如表1。

表1 线性回归方程和检测限Table 1 Regression equations and detection limits

2.3.2 精密度、重复性和稳定性实验

各种有机酸的精密度、重复性和稳定性的RSD分别为:酒石酸1.08%、2.78%、2.28%;苹果酸0.94%、2.00%、0.25%;乙酸 1.16%、1.84%、0.37%;柠檬酸1.05%、2.22%、1.02%。该结果表明所建立的HPLC检测方法精密度、重复性和稳定性均良好。

2.3.3 加样回收率实验

加样回收率见表2，实验结果表明酒石酸、苹果酸、乙酸的平均加样回收率均在90%以上，而柠檬酸偏低，为83.87%。

表2 有机酸的回收率Table 2 Recovery rates of organic acids

15.00 29.64 94.92 30.00 43.82 94.75乙酸Acetic acid 9.08 5.00 13.62 90.79 91.80 15.00 23.07 93.29 30.00 36.48 91.32柠檬酸Citrate acid 70.21 36.57 99.66 80.53 83.87 73.14 132.34 84.95 109.72 164.71 86.13

2.4 香菇样品中有机酸含量

采样优化的提取方法和色谱条件测定香菇中各种有机酸的含量(见表2)，酒石酸为5.98±0.10 mg/g，苹果酸为15.40±0.07 mg/g，乙酸为9.08± 0.40 mg/g，柠檬酸为71.21±0.53 mg/g。可见，香菇中柠檬酸含量远远高于其它三种有机酸。

3 讨论

不同提取溶剂对香菇中的有机酸和其它基质有不同的溶出效果。为了有效的提取有机酸和排除其它基质的干扰，需要找出合适的提取溶剂。本实验中，用低浓度盐酸溶液作为提取溶剂可以很好的达到这一效果。在酸提条件下，对有机酸的提取时间和料液比进行了优化，并确定提取时间为60 min，料液比为100∶1。

流动相缓冲液中不同盐浓度和pH可以影响有机酸的分离效果。本试验建立了同时测定4中有机酸的色谱条件为:Agela Venusll MP C18色谱柱，2%甲醇-20 mmol/L磷酸二氢铵(pH 2.40)作为流动相，流速1.0 mL/min，柱温35℃，紫外检测波长210 nm，进样量10 μL。在此条件下，4中有机酸得到了很好的分离。另外对有机酸的色谱条件进行了方法学验证，实验结果表明色谱条件的线性、精密度、重复性、稳定性以及回收率都很高。该色谱条件的建立适用于大批香菇样品中有机酸的检测与分析。

1Dong YY(董园园)，Dong CX(董彩霞)，Lu YL(卢颖林)，et al.Study on the methods of extraction organic acids from different plant tissue by HPLC.J Nanjing Agric Univ(南京农业大学学报)，2005，28:140-143.

2 Arnetoli M，Montegrossi G，Buccianti A，et al.Determination of organic acids in plants of Silene paradoxa L.by HPLC.J Agric Food Chem，2008，56:789-795.

3 Zheng YJ，Duan YT，Zhang YF，et al.Determination of organic acids in red wine and must on only one RP-LC-column directly after sample dilution and filtration.Chromatographia，2009，69:1391-1395.

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5 Zhang H，Zhou F，Ji B，et al.Determination of organic acids evolution during apple cider fermentation using an improved HPLC analysis method.Eur Food Res Technol，2008，227: 1183-1190.

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7 Jia HF(贾洪锋)，He ZF(贺稚非)，Li HJ(李洪军)，et al.Analysis of organic acids in fermented Capsicum by reverse phase high performance liquid chromatography.Food Sci(食品科学)，2008，29:374-379.

8 Standardization administration of the people’s republic of china(国家标准化管理委员会).GB/T 5009.157-2003 Determination of organic acid in foods(GB/T 5009.157-2003食品中有机酸的测定).Beijing:Standards Press of China，2003.315-319.

9 Sun RL，Zhou QX，Jin CX.Cadmium accumulation in relation to organic acids in leaves of Solanum nigrum L.as a newly found cadmium hyperaccumulator.Plant Soil，2006，285: 125-134.

Determination of Organic Acids in Lentinus edodes by HPLC

HE Xu-kong1，2，3，XING Zeng-tao1，2，RAO Qin-xiong1，2，ZHAO Xiao-yan1，2*，ZHAO Ming-wen31Institute for Agri-food Standards and Testing Technology，Shanghai Academy of Agricultural Science;2Supervision and Testing Center for Edible Fungi Quality，Ministry of Agriculture，Shanghai 201403，China;3College of Life Sciences，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China

In this experiment，an HPLC method for determination of organic acids in Lentinus edodes was developed.These organic acids contained tartrate acid，malic acid，acetic acid and citrate acid.Under acid extraction，Agela Venusll MP C18column was used at 35℃ and mobile phase was 2%CH3OH-20 mM(NH4)2HPO4(pH2.40)，with the flow rate of 1.0 mL/min.Detection wavelength was 210 nm.Four organic acids were well separated in 8 minutes.The method is accurate，reliable，rapidly and simple with low detection limit.It is suitable for the analysis and determination of samples in large quantity.

HPLC;Lentinus edodes;acid extraction;organic acids

1001-6880(2012)10-1444-05

2011-12-29 接受日期:2012-04-18

国家科技支撑计划项目(2009BADB7B06)

*通讯作者 Tel:86-21-62202832;E-mail:cindy8119@163.com

TS207.3

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