神秘果种子蛋白质的提取与降糖效用研究

黄巨波，刘 红，卢圣楼，张 浩

海南师范大学化学与化工学院，海口571127

神秘果种子蛋白质的提取与降糖效用研究

黄巨波，刘 红*，卢圣楼，张 浩

海南师范大学化学与化工学院，海口571127

本文研究神秘果种子蛋白质(SDSP)的提取条件及其降糖效用，通过考察固液比、pH值、时间和温度等因素对SDSP提取率的影响来优化提取蛋白质的条件，并利用四氧嘧啶诱导糖尿病小鼠模型分析神秘果种子蛋白质的降糖效果。实验方法如下:将实验组小鼠分为正常对照组、糖尿病模型组、SDSP实验组(200 mg/kg)和阳性对照组(80 mg/kg二甲双胍)，灌胃14 d后测量空腹血糖值(FBG)，胰岛素含量和体重。实验结果表明SDSP的最佳提取工艺条件为固液比1∶20、pH 8.5、时间120 min、温度50℃。测定SDSP组的FBG含量比模型组降低46%，而胰岛素含量则增加约4倍。实验表明SDSP显著降低糖尿病小鼠空腹血糖值，促进胰岛素的分泌。

神秘果;蛋白质;四氧嘧啶;降糖效用

神秘果为山榄科(Sapotaceae)神秘属(Synsepalum)常绿灌木，是一种稀有的种植资源，原产于西非，自然分布在西非刚果一带，在印度尼西亚的丛林中也有发现，自20世纪60年代起先后引入我国海南、广东、广西、福建等省区种植［1，2］。近期研究发现，果实中含有的神秘果素除了能够改变味觉外［3，5］，还具有改善胰岛素抵抗的功能［4］，说明神秘果可作为糖尿病人的辅助治疗药物进行开发利用，为进一步考察神秘果对糖尿病的治疗作用［6］，本文从神秘果种子中提取蛋白质，确定最佳工艺条件，并用提取出的蛋白质对小鼠进行实验，研究其对糖尿病小鼠的降血糖效用［7-9］，为糖尿病治疗进一步提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要药品和仪器

新鲜神秘果(海南本地)由海南师范大学生命科学院钟琼芯副教授鉴定

昆明种♂小鼠由广州中医药大学实验动物中心提供，生产许可证号:SCXK(粤)2008-0020

血糖仪(三诺安稳)小鼠胰岛素试剂盒(南京建成生物工程研究所)四氧嘧啶和牛血清白蛋白(Sigma公司)二甲双胍(石家庄普力制药)其余试剂均为分析纯

1.2 神秘果种子蛋白质(SDSP)的提取

将新鲜的神秘果去除果肉得种子，冷冻干燥、研磨，得神秘果种子粉，用凯氏定氮法测其蛋白质含量［10］。准确称取神秘果种子粉(2 g左右)于消化瓶中，加入催化剂(K2SO4和CuSO4)，浓H2SO420 mL，消化至呈绿色，冷却加水定容，用硼酸作吸收液，反应室内加入浓NaOH，用0.05N HCl滴定。在神秘果种子粉中加入石油醚或环己烷搅拌脱去其油脂部分，抽滤分离，在去除油脂的种子粉中加入磷酸盐的缓冲溶液(并加入少量的巯基乙醇和氯化钠，以防止蛋白质变性和有利于蛋白质的溶解)，室温搅拌过夜，抽提得到蛋白质提取液。取抽提液样品稀释至适当的倍数，用考马斯亮蓝法(即Bradford法)测定粗提液中蛋白质含量［11］，计算提取率(粗蛋白提取率=粗提液中蛋白质质量/种子粉中蛋白质质量)。

1.3 正交实验

为确定SDSP的最佳提取条件，设计以固液比、pH值、时间和温度为条件的L9(34)正交优化实验，各因素所取条件见表1所示。

表1 SDSP提取正交实验因素和水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment of extraction of SDSP

1.4 降糖活性研究

1.4.1 建立糖尿病模型

预选健康♂小鼠40只(20 g左右)，先适应性饲养一周，禁食12 h，腹腔注射四氧嘧啶180 mg/ kg，72 h后空腹血糖值12 mmol/L以上为高血糖小鼠，造型成功。

1.4.2 神秘果蛋白对糖尿病小鼠的降血糖研究

取10只正常小鼠作为(1)空白对照组，和上述造型成功的高血糖值小鼠30只，按血糖值、体重随机分为(2)模型组(蒸馏水)，(3)实验组(200 mg/kg SDSP)，(4)阳性对照组(80 mg/kg二甲双胍)，每组10只。小鼠分笼饲养，按剂量灌胃一次/天，空白对照组和模型组灌蒸馏水，实验组灌胃SDSP 200 mg/ kg，阳性对照组灌胃二甲双胍80 mg/kg，自由进食、饮水，记录饮水量，测体重、血糖值/周。实验第14天，禁食12 h，腹腔注射500 mg/kg葡萄糖，90 min后测量血液中胰岛素含量。

1.5 数据处理方法

2 实验结果

2.1 神秘果提取条件优化

以牛血清蛋白(BSA)作为标准，以蛋白质浓度为横坐标，A595为纵坐标作蛋白质浓度标准曲线，如图1，由此可测得各粗提取液中蛋白质含量。

图1 蛋白质标准曲线Fig.1 Standard curve of protein

各组试验神秘果种子蛋白质提取率和极差分析结果见表2，方差分析见表3。对表2数据进行直观分析可知，以蛋白质提取率为评价指标，各因素的影响顺序为:固液比＞温度＞pH＞时间，最佳工艺条件为A3B1C3D2。方差分析结果显示:固液比F= 1.549和温度F=1.56＜F(2，8)0.05=4.46，说明固液比和温度对蛋白质提取率都没有显著性影响，即表明在实验操作条件下温度40～60℃以及固液比10∶1～20∶1条件下对蛋白质提取率的影响不显著。综合以上情况考虑，选取A3B1C3D2，即温度50℃、pH值8.5、固液比1∶20、时间120 min为最佳提取工艺条件提取SDSP，提取率可达到80.3%。

为考察上述最佳提取工艺的可操作性和稳定性，严格按照工艺条件要求提取SDSP 3次，进行验证试验。结果表明:按优选的最佳工艺条件提取SDSP，提取率较高，且工艺稳定。

表2 正交试验结果Table 2 Results of orthogonal experiment of extraction rate

表3 方差分析结果Table 3 Analysis of variance

2.2 降血糖实验

模型组小鼠“三多一少”症状明显，并逐渐加重;而实验组和阳性对照组小鼠症状较轻，且逐渐缓解。表4中各项实验数据表明，喂食SDSP的糖尿病实验组小鼠空腹血糖值较模型组降低，差异显著(P＜0.01)，阳性对照组小鼠血糖值也明显降低(P＜0.01)。实验结束时，实验组和阳性对照组小鼠的血糖值趋近于正常值，实验组小鼠腹腔注射葡萄糖后胰岛素含量高于模型组，差异显著(P＜0.01)。较模型组，正常对照组小鼠体重增加，差异显著(P＜0.01)，实验组和阳性对照组小鼠体重增加，差异不显著。

表4 SDSP对糖尿病小鼠血糖值、胰岛素含量和体重的影响(±s，n=10)Table 4 Effects of SDSP on FBG，INS and weight of diabetes mice(±s，n=10)

表4 SDSP对糖尿病小鼠血糖值、胰岛素含量和体重的影响(±s，n=10)Table 4 Effects of SDSP on FBG，INS and weight of diabetes mice(±s，n=10)

与模型组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01Compared with model group:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

体重(g)组别Group剂量(mg·kg－1) Dosage血糖值(mmol/L) Blood glucose level胰岛素含量(mU/L) Insulin content Weight 0 d 7 d 14 d 14 d 0 d 14 d正常对照组 － 5.8±0.4＊＊ 5.6±0.3＊＊ 5.6±0.2＊＊ 18.3±2.6 21.4±0.5 28.4±0.8＊＊模型组 － 16.5±2.6 15.6±2.9 15.2±3.0 20.6±7.8 20.1±1.1 20.8±1.8实验组 200 16.2±2.2 13.5±2.6* 8.1±2.4＊＊ 79.5±6.1＊＊ 20.7±0.9 23.2±3.4*阳性对照组 80 16.8±1.8 14.3±2.1* 7.5±2.4＊＊ 25.3±6.6 21.7±1.5 22.2±2.9*

3 讨论

现有治疗糖尿病的药物一般是通过刺激残存β细胞的胰岛素分泌［12］，或是抑制胰高血糖素分泌，来降低和控制患者的血糖值，而四氧嘧啶是一种特异性的β细胞毒剂，可选择性地损坏多种动物的胰岛β细胞，引起实验性糖尿病。研究糖尿病治疗药物疗效的常用动物模型为四氧嘧啶糖尿病小鼠。

本实验通过设计正交实验，优选出提取SDSP的最佳工艺条件为温度为50℃、pH值为8.5、固液比为1∶20、时间为120 min。在降血糖实验中，实验组小鼠血糖值较模型组降低(P＜0.01)，空腹注射葡萄糖后胰岛素含量高于模型组(P＜0.01)，说明SDSP能有效地降低糖尿病小鼠空腹血糖值和促进胰岛素的分泌，但其分离纯化、降糖机理等还需进一步研究证明。

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Study on Hypoglycemic Activity and Extraction of Synsepalum Dulcificum Seed Protein

HUANG Ju-bo，LIU Hong*，LU Sheng-lou，ZHANG Hao
College of Chemistry and Chemical Engineering，Hainan Normal University，Haikou 571127，China

To investigate the extraction efficiency and hypoglycemic activity of Synsepalum Dulcificum seed protein(SDSP)，conditions are investigated by the ratio of solid to liquid，pH，time and temperature to get better extract rate，the hypoglycemic activity in diabetic mice induced by intraperitoneal injection of alloxan(180 mg/kg)were done as follows.All the mice were divided into four groups randomly，including normal control group，model group，SDSP group(200 mg/ kg)，metfomin group(80 mg/kg)，weight and fluid intake were monitored every week，fasting blood glucose(FBG)and insulin were measured after 2 weeks.The optimum extracting conditions:ratio of solid to liquid(w∶v)1∶30，pH 8.5，time 120 min，temperature 50℃.Compared with diabetic model group，the levels of FBG were decreased remarkably to 46%and insulin was increased 4 times in the SDSP group.It demonstrated that the SDSP could significantly lower blood glucose and promote the secretion of insulin of diabetic mice.

Synsepalum Dulcificum;protein;alloxan;hypoglycemic

1001-6880(2012)10-1441-04

2012-01-10 接受日期:2012-06-20

海南省社会发展专项(2010SF007);海口市重点科技计划(2010-086);海南师范大学科技成果转化项目(JJCG1101);海南师范大学实验室开放性项目(KFSY11007)

*通讯作者 E-mail:lhyd123@sohu.com

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