多酶法提取高温菜籽粕中蛋白质的工艺及其优化

刘晓庚 高 梅 陈梅梅 曹祟江 孔令艳 吴 珂 李凤月 彭冬梅

多酶法提取高温菜籽粕中蛋白质的工艺及其优化

刘晓庚 高 梅 陈梅梅 曹祟江 孔令艳 吴 珂 李凤月 彭冬梅

(南京财经大学食品科学与工程学院，南京 210046)

通过比较菜籽蛋白的各种提取方法，设计了以高温压榨菜籽粕为原料，采用多酶解法与碱提酸沉法相结合的新工艺提取菜籽粕蛋白质。在单因素试验的基础上，着重研究酶解过程，并用L9(34)正交优化试验得到了多酶酶解最佳工艺条件为:pH为9．0，温度为50℃，料液比为1∶10，多酶以α－淀粉酶+纤维素酶为宜，且加入量为α－淀粉酶90 U/g粕、纤维素酶45 U/g粕;在此最优条件下的验证实验所得蛋白质提取率为98．96%，菜籽蛋白产品的蛋白质含量为99．04%，产品为无特殊气味浅黄色的细晶粒和粉末固体。

高温菜籽饼粕 蛋白质 提取 酶解法 紫外分光光度法

油菜(rape)是中国最重要的油料作物，20世纪80年代以来，我国油菜种植面积和油菜籽总产量均居世界首位，占世界油菜种植面积和总产量近30%［1］。油菜籽除含大量油脂外，还含25%～27%蛋白质，制油后菜籽粕含35%～45%蛋白质［2］。目前，菜籽浓缩蛋白的制备工艺主要是从大豆浓缩蛋白的制备工艺演变而来。但是菜籽蛋白没能像大豆蛋白那样应用广泛，原因主要有两个:一是菜籽中含有硫代葡萄糖苷、植酸、单宁、芥子碱、皂素等毒物和抗营养成分，限制了它在饲料及食品工业中的应用，以致造成蛋白质资源的浪费;二是对菜籽蛋白的研究力度远不及对大豆蛋白的研究，直到20世纪90年代，国内外学者才逐渐花精力到菜籽蛋白的研究当中。

从菜籽粕中提取蛋白质的主要方法有水相法［3－4］、有机溶剂法［5］，另一些是在水相萃取基础上的辅助提取法，如超声微波辅提法［6］、水相酶解法［7］、双液相萃取法［8－9］、碱提酸沉与超滤相结合方法［10－12］、Burco法［13］等，这些辅助法均提高了蛋白质提取率。经分析比较后设计了提取菜籽粕蛋白质的新方案。

1 材料与方法

1．1 主要材料和仪器

高温菜籽粕:南京隆盛植物油脂有限公司;α－

BS 224S电子天平:北京赛多利斯仪器系统有限公司;PHS－3C型pH计:上海精密科学仪器有公司;HH－2数显恒温水浴锅:国华电器有限公司;RE52CS旋转蒸发器:上海亚荣生化仪器厂;LD5－10低速离心机:北京医用离心机厂;UV－8000A紫外/可见分光光度计:上海元析仪器有限公司。

1．2 试验方法

1．2．1 菜籽粕的预处理方法

将菜籽粕敲碎成小块，粉碎过80目标准筛，装入滤纸包后置于索氏脂肪提取器中，用石油醚浸提脱油，直至索氏抽提桶中的液体澄清。取出菜籽粕粉，让石油醚蒸发晾干，装于密封袋备用。

1．2．2 菜籽粕蛋白质的提取方法

1．2．2．1 酶解方法

称取10 g(准确至0．01 g，下同)预处理过的菜籽粕粉，按料液比1∶10加入磷酸缓冲液和蒸馏水共100 mL，水浴锅50℃，加入一定量的酶，50～100 r/min搅拌，反应3 h。反应完成后，3 000～4 000 r/min离心20 min。上层清液(可稀释后)用紫外吸收光度法测定菜籽蛋白溶液吸光度(ΔA280)，计算蛋白质的提取率［14］。

蛋白质提取率=(上清液中菜籽蛋白质的量/菜籽粕粉中蛋白质的量)×100%

1．2．2．2 碱提酸沉蛋白质制备方法

取1．2．2．1中离心后的下层沉淀加120 mL水，0．5 mol/L NaOH调pH至10．0，保持55℃搅拌2 h，3 000 r/min离心20～30 min，合并两次上清液，滴加0．5 mol/L HCl调pH至4．0，有沉淀析出，静置15～20 min后，4 000 r/min离心20～30 min，下层沉淀再加5倍体积70%乙醇，室温振荡下浸提30～40 min，3 000 r/min离心15～20 min，分别用2倍体积水洗涤2～3次，3 000～4 000 r/min离心15～20 min，下层沉淀冷冻干燥即得菜籽蛋白质，称重，计算蛋白质得率。

蛋白质得率=(菜籽蛋白质制品的质量/菜籽粕粉的质量)×100%

1．2．3 蛋白质含量的测定方法

蛋白质含量的测定采用紫外吸收分光光度法［14］，以试剂空白做对照。经试验测得蛋白质浓度为0～1．00 mg/mL内，其线性方程为ΔA280=0．652c－0．005 7，且R2=0．999 8。

1．2．4 数据处理

本试验采用Microsoft Excel 2003软件处理试验相关的数据，用直观分析法和方差分析法来对试验数据进行分析。

2 结果与讨论

2．1 酶的选择

预处理好的菜籽粕中除含蛋白质外，还含一定量的淀粉、纤维素和果胶等，要打破菜籽细胞壁提取蛋白质就要有破解细胞壁的方法，而目前最有效的是酶解破壁法。由于菜籽细胞壁主要是由淀粉、纤维素和果胶等组成，因此，试验选用的酶有α－淀粉酶、纤维素酶、果胶酶。为准确快捷地得到酶解法提取菜籽粕蛋白质的条件，先将这3种酶的适用条件列出(表1)。

表1 酶的适用条件

2．2 α－淀粉酶用量的确定

分别选择0、60、90、120、150、210、300 U/g粕用量的α－淀粉酶按1．2中的试验方法测定其对蛋白质提取率的影响(见图1)。由图1可知，随着α－淀粉酶的增加菜籽蛋白溶液中溶出的蛋白质越多，且0～0．04 g有较好的线性关系，考虑到酶的用量带来的试验成本问题，所以，α－淀粉酶的用量确定为0．03 g即 α －淀粉酶的酶活力为90 U/g粕为宜。

图1 α－淀粉酶对菜籽粕蛋白质提取的影响

2．3 α－淀粉酶与纤维素酶活力比的确定

在α－淀粉酶用量试验的基础上按α－淀粉酶与纤维素酶的酶活比分别为1∶2、1∶1、3∶2、4∶3、2∶1、5∶2添加纤维素酶，其结果如图2。由图2可知，当α－淀粉酶与纤维素酶的酶活比为2∶1时，蛋白质的提取率为最大，达92．54%，故接下来的试验所用α－淀粉酶与纤维素酶的酶活比选定为2∶1。

图2 α－淀粉酶与纤维素酶活力比对菜籽粕蛋白质提取的影响

2．4 果胶酶用量的影响

在确定了α－淀粉酶与纤维素酶的酶活比为2∶1的基础上，继续分别按0、5、10、20、30、50、100 U/g粕的量添加果胶酶进行试验，以探明多酶共同作用下对菜籽粕蛋白质提取的影响，所得试验结果见图3。从图3可知，添加果胶酶对菜籽中蛋白质的提取几乎没有贡献，蛋白质提取率仍稳定在92．67%～92．75%，较不加果胶酶的92．54%仅提高了0．14%～0．23%。

图3 果胶酶用量对菜籽粕蛋白质提取的影响

2．5 酶法(α－淀粉酶、纤维素酶)提取菜籽蛋白质条件的优化

固定反应时间3 h，并以反应温度、酶的用量(α－淀粉酶与纤维素酶的酶活比为2∶1)、pH和料液比4个因素为进一步优化考察的对象，依据优化理论设计L9(34)正交试验来优化确定其最佳工艺条件［15－16］。该正交试验因素表见表2，其试验结果与分析见表3。

表2 L9(34)正交试验因素表

表3 L9(34)正交试验的结果及分析(n=3)

由表3可以看出，采用方差分析法分析各因素对菜籽粕蛋白质提取影响顺序为:pH＞料液比＞酶的用量＞反应温度。可见反应pH对蛋白质提取的影响最大，属极显著的影响因素，而反应温度的影响最小。正交试验优化得到的提取菜籽粕蛋白的最优条件为:反应温度为50℃、酶用量为135 U/g粕(α －淀粉酶90 U/g粕、纤维素酶45 U/g粕)、pH为9．0、料液比为1∶10。

2．6 最佳试验条件的确定及试验验证

根据正交试验所得的酶法提取菜籽粕蛋白的最优方案，依试验设计的理论［15］推算出酶法提取菜籽蛋白的理论最优提取率为:

在此最佳条件下进行的验证试验结果表明蛋白质的提取率为98．96%，与理论推算的107．12%相差7．62%。产生此差别的原因可能来自3个方面，首先是试验操作过程中的误差，如过滤时的粘壁等;其次是正交优化试验和该推算方法本身模式与试验的实际存在不吻合造成误差;还有就是紫外吸收法本身存在测定误差以及紫外分光光度计受测定环境条件等也可造成误差。

所得蛋白质提取液经冷冻干燥等操作制得无特殊气味、浅黄色的微细晶粒和粉末混合的固体状产品，经测定该产品的蛋白质质量分数为99．04%，菜籽粕中蛋白质得率为28．37%，但该蛋白质产品的性能和应用有待进一步研究。

3 结论

3．1 用单一的酶法提取菜籽粕蛋白质远没有多酶法效果显著，用α－淀粉酶时蛋白质的提取率仅为72．52%而用α－淀粉酶+纤维素的多酶法提取菜籽粕蛋白质时，蛋白质的提取率可达98．96%。但果胶酶对高温菜籽粕中蛋白质提取几乎没有贡献作用。

3．2 通过正交试验优化得到的多酶法提取高温菜籽粕中蛋白质的最佳工艺条件是:pH 9．0，温度为50℃，料液比为1∶10，多酶以α－淀粉酶+纤维素酶为宜，且加入量为α－淀粉酶90 U/g粕、纤维素酶45 U/g粕;在此最优条件下的验证试验所得蛋白质提取率为98．96%，菜籽蛋白产品的蛋白质含量为99．04%，产品为无特殊气味浅黄色的细晶粒和粉末混合固体。

3．3 本试验设计的多酶法提取蛋白质方案是适合高温菜籽粕中蛋白质提取的，但对工业化生产应用尚须进一步进行放大试验等研究工作。

［1］中华人民共和国国际统计局编．2010国际统计年鉴［M］．北京:中国统计出版社，2010

［2］王晓凡，熊光权，汪兰，等．菜籽蛋白提取及应用研究进展［J］．粮食与油脂，2010(12):5－9

［3］陈翊平，刘晓宇，高政，等．菜籽饼粕中蛋白质的提取分离技术及应用研究进展［J］．农产品加工，2008(4):4－7

［4］刘大川，周俊梅，张寒俊，等．低植酸、低单宁“双低”菜籽分离蛋白制备工艺的研究［J］．中国油脂，2005，30(8):38－41

［5］曾晓波，吴谋成，王海英．丙酮浸提法制取菜籽浓缩蛋白［J］．中国粮油学报，2001，16(4):10－13

［6］金晶，徐志宏，魏振承，等．超声微波辅助法提纯菜籽蛋白的研究［J］．现代食品科技，2009，25(3):275－278

［7］刘志强，令玉林，曾云龙，等．水相酶解法提取菜籽油与菜籽蛋白工艺的优化［J］．农业工程学报，2004，20(3):163－166

［8］王车礼，史美仁．菜籽粕脱毒提取菜籽蛋白研究进展［J］．中国油脂，1997，22(2):36－40

［9］王车礼，史美仁．液选法制取菜籽浓缩蛋白［J］．粮食与饲料工业，1997(8):21－23

［10］姜绍通，蒋连平．菜籽饼粕中分离蛋白的制备［J］．食品科学，2007，28(12):161－164

［11］Rastogi N K，Rashmi K R．Optimization of enzymatic liquefaction of mango pulp by response surface methodology［J］．Eur Food Res Techmol，1999，209:57－62

［12］Annadurai G．Design of optimum response surface experiments for adsorption of direct dye onchitosan［J］．Bioproc Eng，2000，23:451－455

［13］袁建，刘胜，鞠兴荣，等．复合法提取高温菜籽粕中蛋白质的研究［J］．中国油脂，2010，35(1):19－23

［14］GB 5009．5—2010食品中蛋白质的测定［S］

［15］蒋子刚，顾雪梅．分析测试中的数理统计与质量保证［M］．上海:华东化工学院出版社，1991

［16］白新桂．数据分析与实验优化设计［M］．北京:清华大学出版社，1987．

The Technology and Optimization for Multi－Enzymatic Extraction Protein from High－Temperature Rapeseed Meal

Liu Xiaogeng Gao Mei Chen Meimei Cao Chongjiang Kong Lingyan Wu Ke Li Fengyue Pen Dongmei
(School of Food Science and Engineering，Nanjing University of Finance＆Economics，Nanjing 210046)

By comparing a variety of rapeseed protein extraction method，we designed high－temperature pressed rapeseed as raw material and applied the new technology which combines multi－enzyme with alkaline extraction and acid precipitation to extract rapeseed meal protein．Based on the single －factor test，the study focused on the enzymatic process，and made L9(34)orthogonal experiment to get the optimum conditions of multi－enzyme digestion:pH 9．0，temperature 50℃，solid－liquid ratio of 1∶10．A multi－enzyme withα－amylase+cellulase was appropriate，and the added amount wasα－amylase 90 U/g，and cellulase 45 U/g．Under the optimal conditions，the protein extraction ratio derived from verification experiment was 98．96%，and the protein content of rapeseed protein products was 99．04%．The products were fine grain and light yellow powder solid with no special odor．

high－temperature rapeseed meal，protein，extraction，enzymatic hydrolysis，UV spectrophotometry

TQ644．16;TS201．1;TS224．4

A

1003－0174(2012)08－0069－04

江苏省高校科研成果产业化推进项目(ZL10001)

2011－10－27

刘晓庚，男，1962年出生，教授，硕士生导师，食品科学淀粉酶:北京双旋微生物培养基制品厂;纤维素酶、果胶酶:上海蓝季科技发展有限公司;蛋白质标准品牛血清蛋白:Sigma公司;KH2PO4(分析纯)等化学试剂:国药集团化学试剂有限公司。pH 5．0、7．0的磷酸盐缓冲液和pH 9．0的硼酸盐缓冲液:自配;蛋白质标准溶液:准确称取经微量凯氏定氮法校正的标准蛋白质，配制成浓度为1．00 mg/mL的溶液。