几种检测弓形虫血清抗体方法的比较分析

刘 帅，王贝贝，崔丽丽，靳兴军，张 跃，沈光年，汪 明

（1.中国农业大学动物医学院 国家动物原虫实验室，北京 海淀100193；2.北京市兽医实验诊断所，北京 朝阳100101）

弓形虫是一种人畜共患的细胞内寄生原虫，在人和动物的各种有核细胞内都可寄生与繁殖。对人类健康和畜牧业生产均造成重大威胁。应用血清学技术检测特异的抗体仍然是诊断弓形虫感染的主要手段。但目前国内外商品化的检测试剂盒检测效能差异颇大，难以判定其真实性［1］。本实验室对国内间接血凝试验（IHA）、间接ELISA、SPA－ELISA 弓形虫IgG抗体检测试剂盒和本实验室自建的改良凝集试验（MAT）进行比较分析。

1 材料与方法

1.1 血清 2010年8月采自北京顺义与大兴区猪场的80份血清样本。由北京市兽医实验诊断所提供。

1.2 检测试剂和试剂盒 改良凝集试验（MAT）试剂由本实验室自制。参照Dubey［2］等人1987年发明的改良凝集试验方法，改进速殖子纯化条件，优化检测所需弓形虫速殖子抗原量，固定速殖子全虫为诊断抗原液。血清凝集效价1∶25以上者判为阳性。

间接血凝试验（IHA）试剂，购自中国农业科学院兰州兽医研究所。生产批号：20110529。

间接ELISA试剂盒，购自深圳康百得生物技术有限公司：猪弓形虫抗体检测试剂盒。生产批号：20110613。检测时所有血清分为两个稀释度1∶100与1∶200，称为ELISA－100，ELISA－200。

SPA－ELISA试剂盒，购自珠海海泰生物制药有限公司，动物弓形虫IgG抗体酶联免疫检测试剂盒。生产批号：20110501。

1.3 检测试验 采集的血清样本用上述试剂或试剂盒进行了平行检测，试验操作及结果判定按试剂盒说明书进行。

阳性样本标准：参照全国第二届弓形虫病学术讨论会（武汉，1993.11）推出的诊断方案［3］，有3次或以上检测结果为阳性者判定为阳性标准样本。

1.4 评价指标 符合率：两种方法检测结果一致的样本数与检测总样本数之比；敏感性：对阳性标准样本检测为阳性的概率；特异性：对阴性样本检测为阴性的概率；检测效率：检测结果符合实际情况的样本数与总检测样本数之比；Youden指数：敏感性＋特异性－1，Youden指数检验采用U检验式［4］。

2 结果

2.1 平行检测血清结果 平行检测80份样品，ELISA－100检出阳性57份；ELISA－200检出阳性21份；SPA－ELISA检出阳性21份；IHA检出阳性17份；MAT检出阳性18份。5次检测的血清阳性率分别为：71.3%，26.3%，26.3%，21.3%，22.5%。见表1。经χ2检验，ELISA－100检测血清抗体阳性率（71.3%）高于其他4种方法检测的血清阳性率（21.3%～26.3%），且差异极显著（P＜0.01）。ELISA－200、SPA－ELISA、IHA、MAT 4种方法检测的血清阳性率之间无显著性差异（P＞0.05）。

表1 平行检测猪血清结果

2.2 平行检测结果之间的符合率 平行检测的5次结果中，ELISA－100检测结果与其他检测结果符合率较低（＜55%），其他4次检测结果相互之间的符合率都在70%以上，其中ELISA－200与IHA检测结果符合率最高，为87.5%。见表2。经配对卡方检验，ELISA－100与其他4种方法检测结果具有极显著差异（P＜0.01）。ELISA－200、IHA、MAT、SPA－ELISA 4种方法检测结果两两之间无显著差异（P＞0.05）。

表2 5种方法检测结果符合率 （%）

2.3 各检测方法的敏感性、特异性、检测效率及Youden指数 在平行检测的80份血清样本中，符合阳性标准的样本共20份。5次检测中ELISA－200的敏感性（90%）、特异性（95%）和检测效率（93.75%）均在90%以上，Youden指数为0.85，显著高于其他4种方法。其次是IHA，敏感性稍低（50%），特异性和检测效率都达到90%以上，Youden指数属于中等。本实验室自建的MAT方法敏感性稍低（50%），特异性较好，为88.3%，检测效率为 81.25%，Youden指数为 0.483。SPAELISA敏感性、特异性和检测效率属于中等，Youden指数为 0.45；ELISA－100 敏感性高，为100%，但是特异性低，仅38.3%，检测效率和Youden指数显著低于其他方法。见表3。

3 讨论

随着对弓形虫研究的不断发展和深入，新的诊断技术不断被开发和建立，目前国内外弓形虫感染的诊断技术已经超过10多种，包括一些分子生物学诊断技术［5］。但由于弓形虫感染的特点，在弓形虫感染的诊断中，免疫学方法仍占有极重要的地位，MAT、ELISA、IHA都是广泛应用在弓形虫感染诊断和流行病学调查中的血清学方法。改良凝集试验（MAT）是20世纪80年代，Dubey和Desmonts建立的［2］，是特异敏感的检测方法［6］，迄今一直在欧美各国广泛应用于动物和人弓形虫病的流行病学调查［7－8］。间接血凝试验（IHA）操作简便快速，作为我国全国性的人、畜弓形虫病流行病学调查方法而被普遍使用。ELISA具有高敏感性和特异性、易于标准化，是目前诊断弓形虫发展最快、应用最广的技术［9］。

表3 5种方法的敏感性、特异性、检测效率和Youden指数

近来年弓形虫检测方法逐渐增多，市场上也有多家生产厂商的检测试剂盒产品，但我们前期的试验结果显示，不同检测方法，不同生产厂家，甚至不同生产批号的检测试剂盒检测的结果都有较大差异。张述义等人［1，10－12］对国内外一些检测试剂盒进行了比较分析，发现这些试剂盒检测结果也有显著差异。Mainar－Jaime等人的研究也指出，检测方法的差异大小随被检动物的不同而不同，需根据被检动物的不同而评估使用的检测方法［13］。因此我们在开展大规模的流行病学调查前必须对各种方法进行比对，从中选择检测效率相对高的方法开展普查，最大限度的使调查结果贴近真实。另外，对于阳性样品最好还要用另一种方法进行复核。

本试验选择3种市场中的弓形虫抗体检测试剂盒：深圳康百得的猪弓形虫抗体检测试剂盒，珠海海泰的动物弓形虫IgG抗体检测试剂盒，兰州兽医研究所的弓形虫间接血凝试剂盒，还有本实验室自建的改良凝集试验检测方法，对其进行了比较分析。

评价检测方法的指标除了常用的检测效率，还增加了Youden指数。Youden指数是分析敏感性和特异性的综合评价指标，可以避免对于敏感性和特异性的偏移，较客观的反映实际情况［4，14］。

深圳康百得猪弓形虫抗体检测试剂盒建议血清稀释倍数为100倍，但是在试验过程中我们发现，100倍稀释检测的结果与其他3种方法检测结果具有极显著性差异，检测效率和Youden指数显著低于其他方法，检测价值低。我们加大血清稀释倍数，改为200倍，检测结果与其他3种方法无显著性差异。敏感性，特异性和检测效率都到达90%以上，Youden指数达到0.85。可以用来进行大规模的流行病学调查和临床诊断。本实验室自建的MAT方法，与 ELISA－200，IHA，SPA－ELISA 平行检测血清样本，经配对卡方检验，与上述三种方法检测结果之间没有显著性差异。敏感性为60%，特异性高为88.3%，检测效率为81.25%，可为初步血清学筛查后核实阳性样本所用。

［1］何艳燕，蒋守富，马杏宝，等.国内外16种弓形虫诊断试剂盒的评估［J］.旅行医学科学，2008（3）：43－45.

［2］Dubey J P，Desmonts G.Serological responses of equids fed Toxoplasma gondii oocysts［J］.Equine Vet J，1987，19（4）：337－339.

［3］张述义，何艳燕，曹琳，等.检测弓形虫IgM抗体的3种试剂盒的比较分析［J］.中国人兽共患病杂志，2001（3）：72－74.

［4］陈平雁.诊断试验的评价指标及其应用［J］.中国卫生统计，1991（5）：53－57.

［5］王艳华，李学瑞，张德林，等.弓形虫病诊断方法研究进展［J］.中国兽医寄生虫病，2008（1）：28－33.

［6］Dubey J P.Validation of the specificity of the modified agglutination test for toxoplasmosis in pigs［J］.Vet Parasitol，1997，71（4）：307－310.

［7］Dubey J P，Thulliez P，Romand S，etal.Serologic prevalence of Toxoplasma gondii in horses slaughtered for food in North America［J］.Vet Parasitol，1999，86（4）：235－238.

［8］Garcia－Bocanegra I，Simon－Grife M，Dubey J P，etal.Seroprevalence and risk factors associated with Toxoplasma gondii in domestic pigs from Spain［J］.Parasitol Int，2010，59（3）：421－426.

［9］Hill D E，Chirukandoth S，Dubey J P，etal.Comparison of detection methods for Toxoplasma gondii in naturally and experimentally infected swine［J］.Vet Parasitol，2006，141（1－2）：9－17.

［10］蒋守富，张述义，潘彩娥，等.5种市售弓形虫抗体检测试剂盒的评价［J］.中国人兽共患病杂志，2003（1）：97－99.

［11］张述义，魏梅雄，王龙英，等.改良凝集试验（MAT）与间接血凝试验（IHAT）和酶联免疫吸附试验（ELISA）检测弓形虫抗体的比较分析［J］.寄生虫与医学昆虫学报，2001，8（4）：199－203.

［12］牛安欧，冯友仁，刘文琦.几种弓形虫ELISA试剂盒初步检测结果比较［J］.中国人兽共患病杂志，2000（4）：56－58.

［13］Mainar－Jaime R C，Barberan M.Evaluation of the diagnostic accuracy of the modified agglutination test（MAT）and an indirect ELISA for the detection of serum antibodies against Toxoplasma gondii in sheep through Bayesian approaches［J］.Vet Parasitol，2007，148（2）：122－129.

［14］陈平雁，王斌会，莫一心.几种诊断试验统计方法的比较［J］.中国卫生统计，1995（5）：8－11.