GAS41基因在斑马鱼胚胎发育中的时空表达谱

周芳亮，胡 翔，吴文韬，杨子剑，李 莉，向双林，韩 梅，丁小凤

(湖南师范大学生命科学学院蛋白质化学与发育生物学教育部重点实验室,中国 长沙 410081)

基因扩增是人类肿瘤中基因过量表达的一个主要原因，其中在人类神经胶质细胞中大量的基因扩增是促进其肿瘤产生的一个决定性因素．神经胶质细胞瘤序列41(GAS41)最初是从星型细胞瘤的4个发展阶段中均扩增到的一段高拷贝的DNA序列，它与转录因子AF-9和ENL结构高度同源[1]．后来研究发现GAS41是一个必需基因，泛素化表达于人类组织细胞核中，其中人脑表达量最高[2-3]．而且GAS41基因在鸡的前淋巴细胞系DT40中定点敲除后，细胞中的RNA合成大量降低，细胞随后死亡．由此可见，GAS41是一个重要的管家基因，决定细胞的生长与存活[4]．此外，GAS41与人类急性白血病融合蛋白MLL/AF10相互作用，参与人类血液恶性转化[5]．GAS41与通用转录因子复合体成员TFIIF相互作用，和特异的转录因子AP-2beta也相互作用促进RNA转录从而参与基因的转录调控[6-7]．最近发现GAS41与磷酸酶PP2Cbeta相互作用，促进了肿瘤抑制基因P53的去磷酸化，进而抑制肿瘤抑制基因P53信号通道[8-9]．因此，GAS41在细胞增殖与肿瘤发生发展中起重要的转录调控作用．

GAS41在胚胎发育中的功能却少有报道，作者选用新型模式生物斑马鱼作为研究对象，它具有体型小、体外受精、生长迅速、产卵量大和胚胎透明等有利特点[10]，便于观察和操作，以此来分析GAS41在胚胎发育中的时空表达谱．本研究发现GAS41是一个高度保守的基因，泛素化表达于斑马鱼成体组织中，特异性表达于胚胎头部．这为进一步研究GAS41在胚胎发育中的功能奠定了基础，同时为揭示GAS41在胚胎发育调控中的机理提供实验依据．

1 材料和方法

1.1 材料

斑马鱼购自武汉中国科学院水生生物研究所，总RNA抽提试剂盒和RT-PCR反转录试剂盒购于QIAGEN，exTaqDNA聚合酶，SP6和T7 RNA聚合酶均为TAKARA产品，限制性内切酶和连接酶购自NEB公司，地高辛标记试剂盒购自Roche，pGEM-T Easy载体为Promega产品，DNA相对分子质量标准购自Fermentas公司，PCR引物合成和DNA测序均在上海生工生物工程有限公司完成，质粒小量提取试剂盒和胶回收试剂盒购自长沙安比奥公司．兔抗GAS41抗体购于Sigma公司，Alexa 488羊抗兔荧光二抗购于Molecular Probes公司．其他常规试剂均购于上海生工生物工程有限公司．

1.2 斑马鱼GAS41基因序列分析

从GenBank中查到斑马鱼GAS41(YEATS4)基因的CDS序列(登录号：BC076436)，GAS41蛋白在不同物种中的序列比对在DNAStar软件Meglign程序上进行，GAS41基因的进化树用CLUSTAL X软件分析．

1.3 RT-PCR

按照总RNA抽提试剂盒说明书分别提取斑马鱼胚胎发育中各时间点和成体斑马鱼各组织的总RNA．然后用RT-PCR方法扩增GAS41 cDNA序列(PCR扩增长度为180 bp)．GAS41的RT-PCR引物序列见表1．PCR的反应条件为：预变性94 ℃ 3 min,变性94 ℃ 30 s,退火60 ℃ 30 s,延伸72 ℃ 30 s,共28个循环，最后72 ℃延伸5 min．扩增产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳后在凝胶成像系统下观察GAS41基因的表达情况．同时扩增β-actin作为内参对照．

表1 引物序列

1.4 反义RNA探针制备

载体构建：采用RT-PCR方法以48 hpf时期斑马鱼胚胎的总RNA为模板扩增GAS41全长cDNA序列(扩增长度为681 bp)．引物序列如表1． PCR的反应条件为：预变性94 ℃ 3 min,变性94 ℃ 1 min,退火56 ℃ 1 min,延伸72 ℃ 1 min,共28个循环，最后72 ℃延伸5 min．将PCR产物插入pGEM-T Easy载体中，重组质粒进行EcoRⅠ和SalⅠ限制性内切酶鉴定和测序分析．

探针制备：重组质粒分别用NcoⅠ和NdeⅠ酶切线性化，经SP6和T7 RNA聚合酶和地高辛标记试剂盒体外转录获得地高辛标记的反义RNA探针和正义RNA探针．

1.5 整体原位杂交

采用40 g/L的多聚甲醛将各个时期的胚胎于4 ℃固定过夜，甲醇梯度脱水，并置于-20 ℃的甲醇中备用．原位杂交主要步骤为：将胚胎梯度复水，用蛋白酶K处理18 hpf时期以后的胚胎，用1×PBST清洗胚胎，于65 ℃杂交炉中将胚胎进行预杂交4 h,然后分别加入反义RNA探针和正义对照RNA探针，于65 ℃杂交炉中杂交过夜．杂交第2天回收探针,以SSCT梯度清洗胚胎,加入anti-Dig-AP抗体与反义RNA探针4 ℃结合过夜．杂交第3天回收抗体并用1×PBST溶液清洗胚胎，然后加入BCIP/NBT(Roche)染液显色,显色完全后用1×PBST溶液冲洗，在显微镜下观察并进行拍照记录结果．

1.6 整体免疫组织化学

采用40 g/L的多聚甲醛将不同发育时期的胚胎于4 ℃固定过夜，将胚胎置于含有10%羊血清的1×PBST中封闭1 h,加入GAS41多克隆抗体(一抗稀释比例1∶200)4 ℃孵育过夜，1×PBST中洗涤30 min×3次．加入Alexa 488羊抗兔荧光二抗(二抗稀释比例1∶100)于4 ℃孵育10 h, 1×PBST中洗涤15 min×3次．最后于荧光显微镜(Zeiss Axioskop 2)下分析荧光信号．

1.7 Western印迹杂交

图1 斑马鱼和部分物种GAS41蛋白的同源性(A和B)与进化树(C)分析

将不同发育时期的胚胎加入真核细胞裂解液[50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.2), 150 mmol/L NaCl, 体积分数为1%的Triton X-100, 10 g/L sodium deoxycholate, 1 g/L SDS] 含蛋白酶抑制剂，提取胚胎总蛋白．加入SDS上样缓冲液，105 ℃金属浴5 min, 将蛋白质作12%的SDS-PAGE，转移至PVDF膜．以10 g/L的脱脂奶粉室温封闭1 h,兔抗GAS41多克隆抗体为一抗,稀释为1∶500；辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG为二抗，稀释为质量分数1∶1 000．用DAB 进行发色显迹．

2 结果与分析

2.1 斑马鱼GAS41基因序列的分析

使用DNAStar软件中的MegAlign程序进行GAS41基因在不同物种中氨基酸同源序列比对分析．结果显示，斑马鱼GAS41蛋白与人类(Homo sapiens)、小鼠(Mus musculu)和大鼠(Rattus)的氨基酸序列同源性都为91.2%．不同物种GAS41蛋白同源氨基酸序列在N端tf2f结构域为保守区域，而在C端激活结构域有一定程度的变异[3]．人类、小鼠和大鼠中的GAS41氨基酸序列同源性高达98.7%～99.6%(图1A,B)．这提示GAS41蛋白质具有高度保守性．

使用CLUSTAL X系统软件进行GAS41在不同物种中的同源序列分析并构建进化树(图1C)．从图中可以看出人类的同源序列与小鼠的GAS41序列亲缘关系最近，其次为大鼠,与斑马鱼GAS41关系稍远．

图2 GAS41在斑马鱼成体组织(A)和胚胎发育不同时期(B)表达情况的RT-PCR分析

2.2 GAS41基因在斑马鱼胚胎发育中的时空表达谱

2.2.1 RT-PCR分析 为了研究GAS41基因在斑马鱼中的作用，作者通过RT-PCR方法检测了GAS41在成体斑马鱼器官组织中的表达．图2A显示GAS41在斑马鱼9种主要的器官组织中均有特异性的扩增条带，其条带信号强度没有显著差异．同时作者分析了GAS41基因在斑马鱼胚胎发育不同时期的表达．GAS41基因在胚胎受精后持续表达，从4 h开始表达量升高，一直到72 h表达量基本不变(图2B)．

2.2.2 整体原位杂交分析 pGEM-T Easy-GAS41重组质粒用NcoⅠ酶切经SP6 RNA聚合酶体外转录获得反义RNA探针，用NdeⅠ酶切经T7 RNA聚合酶转录获得正义RNA探针．RNA探针经20 g/L的琼脂糖凝胶电泳(图3B)，泳道M为DNA marker，泳道1为反义RNA探针，泳道2为正义RNA探针．探针大小约为681 bp,与预期大小相符．因RNA的复杂构型合成的探针在普通凝胶电泳下均跑出2个清晰的条带．

箭头指示GAS41的表达区域：m：中脑；i：间脑；c：小脑；h：后脑．比例尺：200 μm．M: DNA marker；1: 反义探针；2:正义探针图3 GAS41基因在斑马鱼胚胎发育中的整体原位杂交表达谱(A)和GAS41探针电泳图(B)

与正义RNA探针相比，反义RNA探针在前期的实验中证实可特异性结合GAS41．用反义RNA探针分别与不同发育时期的斑马鱼胚胎杂交，图3A结果表明，GAS41在斑马鱼胚胎发育中均可检测到GAS41基因转录，但表达部位不同．GAS41在受精后2 h和4 h普遍性表达，8 h时集中出现在胚胎的一侧， 斑马鱼体节期18 h开始后GAS41特异性表达于胚胎头部，尤其是中脑、间脑、小脑和后脑表达明显，并且GAS41在这些部位的特异性表达一直持续至受精后48 h，专一性表达于脑部中枢神经系统．

2.2.3 整体免疫组织化学 为了进一步证实GAS41在斑马鱼头部的表达，作者采用GAS41抗体和绿色荧光标记的第二抗体通过胚胎整体免疫组织化学方法检测GAS41蛋白质在胚胎发育中的表达情况．在荧光显微镜下观察到受精后24，36和48 h胚胎中明显的绿色荧光(图4A)．信号集中出现在胚胎的头部，尤其是间脑(眼部)和中脑部位高表达．同时检测了GAS41抗体的特异性，图4B为Western印迹分析斑马鱼不同时期GAS41蛋白质的表达，GAS41的多克隆抗体检测到了GAS41(25 000)，与预期蛋白大小相符，条带单一，抗体特异性非常好，也显示GAS41蛋白在斑马鱼胚胎受精后24～48 h均有表达，且表达水平相当．

箭头指示GAS41的表达区域．比例尺：200 μm. M: protein marker图4 GAS41基因在斑马鱼胚胎不同时期表达情况的整体免疫组织化学(A)和Western印迹(B)分析

3 讨论

GAS41是最早在神经胶质细胞瘤细胞系中通过显微切割调节cDNA捕获技术分离到的人类肿瘤中高度扩增的基因[1]．GAS41处于染色体12q13-15区域，共227个氨基酸．GAS41的N端包括tf2f结构域，该结构域普遍存在于YEATS家族转录因子AF9和ENL中，参与基因转录与染色质重排[3，7]．而在GAS41的C端60个氨基酸中包括大量的酸性氨基酸(27%)，是一种带负电荷的酸性α螺旋结构，这是真核转录因子激活结构域的典型特点，也是蛋白质与蛋白质相互作用的区域[3]．GAS41通过C端激活结构域与MLL融合蛋白AF10相互作用参与癌症的发生发展过程[5]．而且GAS41在鸡前淋巴细胞中定点敲除后细胞死亡，GAS41的表达干扰后子宫颈癌HeLa细胞的生长阻滞[4，11]．由此可见GAS41在基因转录调控、细胞增殖和恶性肿瘤中发挥了重要的作用[4-5，8]．但GAS41在胚胎发育中的研究并未有报道．生物信息学软件分析斑马鱼GAS41蛋白质序列与部分物种中GAS41同源性达91.2%，该基因表现出较高的进化保守性，这也说明GAS41基因的重要性．

本研究以斑马鱼为模式动物对GAS41的时空表达谱进行分析，GAS41泛素化表达于成体组织(脑、心脏、肝脏、肾、肌肉、小肠、卵巢、睾丸、眼睛)中，而GAS41在斑马鱼胚胎发育中特异性表达于胚胎头部，尤其是中脑、间脑(眼部)、小脑和后脑表达明显．这与此前的Northern印记杂交显示GAS41在人脑组织中表达量最高是一致的[2-3]，这说明GAS41在不同物种中表达的专一性．GAS41在胚胎体节期特异地表达于头部的中枢神经系统，这些表明GAS41除了维持成体组织正常生理功能外，在中枢神经系统的发育、成熟等过程也扮演了重要的作用．

通过显微注射吗啡啉修饰的反义寡核苷酸使GAS41表达下调，从而分析GAS41对斑马鱼中枢神经系统发育表型及相关信号传导通道的影响，由此揭示GAS41调控中枢神经系统发生的机制，这些问题仍在深入研究．总之，本研究结果为进一步分析GAS41在斑马鱼胚胎发育中的功能奠定了基础，并且为以后深入研究GAS41在哺乳动物发育调控中的作用机理提供了有利的线索．

参考文献：

[1] FISCHER U, HECKEL D, MICHEL A,etal. Cloning of a novel transcription factor-like gene amplified in human glioma including astrocytoma grade I [J]. Hum Mol Genet, 1997, 6(11):1817-1822.

[2] HARBORTH J, WEBER K, OSBORN M. GAS41, a highly conserved protein in eukaryotic nuclei, binds to NuMA [J]. J Biol Chem, 2000, 275(41):31979-31985.

[3] MUNNIA A, SCHUTZ N, ROMEIKE B F,etal. Expression, cellular distribution and protein binding of the glioma amplified sequence (GAS41), a highly conserved putative transcription factor [J]. Oncogene, 2001, 20(35):4853-4863.

[4] ZIMMERMANN K, AHRENS K, MATTHES S,etal. Targeted disruption of theGAS41 gene encoding a putative transcription factor indicates that GAS41 is essential for cell viability [J]. J Biol Chem, 2002, 277(21):18626-18631.

[5] DEBERNARDI S, BASSINI A, JONES L K,etal. The MLL fusion partner AF10 binds GAS41, a protein that interacts with the human SWI/SNF complex [J]. Blood, 2002, 99(1):275-281.

[6] DING X, FAN C, ZHOU J,etal. GAS41 interacts with transcription factor AP-2beta and stimulates AP-2beta-mediated transactivation [J]. Nucleic Acids Res,2006, 34(9):2570-2578.

[7] HEISEL S, HABEL N C, SCHUETZ N,etal. The YEATS family member GAS41 interacts with the general transcription factor TFIIF [J]. BMC Mol Biol, 2010, 11:53.

[8] PARK J H, ROEDER R G. GAS41 is required for repression of the p53 tumor suppressor pathway during normal cellular proliferation [J]. Mol Cell Biol, 2006, 26(11):4006-4016.

[9] PARK J H, SMITH R J, SHIEH S Y,etal. The GAS41-PP2Cβ complex dephosphorylates p53 at serine 366 and regulates its stability [J]. J Biol Chem, 2011, 286(13):10911-10917.

[10] 李 志，姚立群，雷孝锋，等.斑马鱼loc558117基因的多克隆抗体制备[J].湖南师范大学自然科学学报，2011，34(2):75-78.

[11] HARBORTH J, ELBASHIR S M, BECHERT K,etal. Identification of essential genes in cultured mammalian cells using small interfering RNAs [J]. J Cell Sci, 2001, 114(24):4557-4565.