β-环糊精-表柔比星包合物的合成和性质研究

董明南，张友玉

(湖南师范大学化学化工学院，化学生物学及中药分析教育部重点实验室，中国 长沙 410081)

超分子化合物在分子识别和催化方面的广泛应用，引起了科研工作者极大的兴趣[1]．超分子化合物是指在主体分子和客体分子间通过非化学键如范德华力、氢键、包合水的释出及疏水作用或其共同的作用而形成的一类化合物，由于主体分子基本上都具有笼状结构，因此一般意义上又将其称为包合物．β-环糊精(β-CD)是具有代表性的主体分子，是主-客体包合物化学的重要研究对象．它是由7个D吡喃型葡萄糖单元环状连接而成的锥型圆桶状结构，其外侧边框呈亲水性而腔内呈疏水性，能够与各类客体分子如有机物、无机离子、金属配合物甚至惰性气体形成包合物[2]．近年来，随着超分子化学在药学领域的迅猛发展, 超分子作为抗癌药物也成为研究的热点．药物分子与环糊精形成的主客体包合物能改变药物的物理化学性质如溶解性、稳定性、扩散性、化学反应性、光谱性质及电化学性质等，因此，在许多应用上的有利因素如有利于促进药物分子在人体内的消化和吸收，提高药效[3]等．

表柔比星(Epirubicin，简称EPI)又名表阿霉素，是阿霉素的衍生物，一种新的具有广谱抗肿瘤活性的蒽环类抗生素[4]，该药可迅速透入细胞，进入细胞核，抑制核酸的合成和有丝分裂，已在临床上用于治疗乳腺癌、急性白血病、肉瘤SA180(团块性，腹水型)、淋巴瘤、卵巢癌、胃癌、黑色素瘤B16、路易斯肺癌以及结肠癌38等．但由于其对心脏存在一定的毒性[5]且可能导致静脉炎症[6]，生物利用度不高，限制了它在临床上的应用．要解决这些现存的缺陷，如果只是简单地减少药物的用量，虽然副作用也会相应的减小，但同时会影响到药物的治疗效果，较好的方法是将药物运载到病灶处，利用药物的缓释不仅能够达到好的治疗效果更重要的是可以有效地减小药物的毒副作用．基于此，本论文工作研究了β-CD对EPI的包合行为并对其在体外的缓释做了初步探讨并取得了较好的缓释效果，这对于提高EPI的生物利用度和减少其在临床应用上的不良反应具有一定的实际应用价值．

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Infinite M1000全波长多功能酶标仪(瑞士，TECAN， Magellan 6.6 软件控制)；UV-2450型紫外可见分光光度计(Shimazu Co., Japan)；96孔板(Microplates, PS, black, clear, solid bottom, F-bottom)；MH-2微量振荡器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；WH-986静音混合器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；pHS-3C型精密pH计(上海鹏顺科学仪器有限公司)．

图1 盐酸表柔比星的结构

盐酸表柔比星(其结构式如图1，浙江海正药业股份有限公司)，β-环糊精(β-CD ,上海试剂公司，使用前经沸水重结晶两次)，葡萄糖(成都金山化学试剂有限公司)．实验用水为Milli-Q二次蒸馏水(Millipore, ≥18 MΩ·cm)．

储备液的准备：磷酸缓冲液(PBS), 准确称取0.075 6 g KH2PO4和0.397 9 g Na2HPO4用二次蒸馏水配置成50 mL溶液，pH=7.4; 盐酸表柔比星储备液：10 mg盐酸表柔比星加PBS液稀释成10-3mol/L避光保存在-20 ℃冰箱备用；β-环糊精储备液，配置1.30×10-2mol/Lβ-CD的PBS 溶液常温保存备用．

1.2 实验方法

1.2.1 EPI荧光强度的测定 所有荧光光谱测试均使用96孔板．荧光发射光谱测定条件为：激发波长： 485 nm，波长扫描范围： 520～700 nm．

1.2.2 包合物的合成 取6 μL 1.0×10-3mol/L的EPI溶液于54 μL 1.30×10-2mol/L的β-CD溶液中混匀，并对其包合所需环境如pH(2～13)，反应时间(0～5 h)，温度(20～40 ℃)，β-CD浓度(1.5～0.2×10-2mol/L)进行考察．

1.2.3 包合物的体外缓释 取100 μL 1.0×10-3mol/L的EPI溶液于900 μL 1.30×10-2mol/L的β-CD溶液(pH=7.4)中振荡反应1.5 h后离心(13 000 r/min，15 min)弃上清液，留下的沉淀用pH=7.4的PBS液重新分散，反复3次．向最终的沉淀中加入少量PBS分散均匀，平均分成两份，分别加入等量的pH=5.0和7.4的PBS 缓冲液，每隔一定的时间取100 μL溶液测其紫外吸收，随后加入同体积的相应缓冲液，整个过程始终保持溶液的总体积不变．

2 结果与讨论

2.1 β-CD与EPI包合物溶液的荧光光谱

a: β-CD (1.30×10-2 mol/L 54 μL) + EPI (1.0×10-4 mol/L 54 μL)；b: EPI (1.0×10- 4 mol/L)；c: β-CD (1.30×10-2 mol/L)图2 β-CD增敏荧光光谱(pH=7.4, 36 ℃, 1.5 h)

如图2所示，曲线a和曲线b分别为在温度为36 ℃，pH=7.4的条件下KH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液环境中，有无β-CD 存在下EPI的荧光光谱，c则为β-CD的荧光光谱．由图可知，EPI 的最大发射波长为598 nm, 且在632 nm处无明显肩峰．加入β-CD溶液后，荧光强度增加，最大吸收峰位置没有移动而632 nm处出现了明显肩峰．β-CD溶液在520 nm到700 nm波长范围内无荧光发射．这说明EPI与β-CD发生了包合作用．该现象的原因可能是由于β-CD的疏水空腔结构为EPI分子提供了一个良好的疏水环境从而改变了EPI分子周围的微环境，因此减少了EPI分子移动的自由度，避免了失活碰撞和与大量水分子和猝灭剂接触的机会．

2.2 包合条件的考察

为了提高包合效率，作者考察反应条件如pH值、温度、时间以及β-CD浓度对包合反应的影响．如图3(A)可知pH值对EPI荧光强度有较大的影响且在pH 4.0～9.0范围内荧光强度强且稳定．10.0以后随着pH值的增加荧光强度迅速减小．考虑该工作对生命体系的实际应用价值，因此选用pH 7.4的PBS溶液．

作者也考察了温度(如图3B所示)、时间(如图3C所示)及β-CD浓度(如图3D所示)对包合反应的影响，实验结果表明，包合温度对包合物的荧光强度影响很小，故选择36 ℃作为包合温度．当包合反应1.5 h后包合物荧光强度基本趋于稳定，此时的溶液体系呈现一种动态平衡，因此选择1.5 h作为包合物的反应时间．实验发现当β-CD浓度为2.0×10-3mol/L～1.1×10-2mol/L时荧光强度与β-CD浓度呈现很好的线性关系，当β-CD浓度大于等于1.2×10-2mol/L时，包合达到饱和，荧光强度不再随着β-CD浓度的增加而增强，此现象说明了EPI分子进入了β-CD空腔中，这与文献报道相符[7]．

图3 包合物荧光强度随pH值(A)，温度(B)，反应时间(C)，β-CD浓度(D)变化趋势

2.3 溶剂化效应对包合反应的影响

a～d: 乙醇的体积分数: 80%, 60%, 40%, 20%;e: 葡萄糖(1.30×10-2 mol/L) + EPI; f: EPI. 图4 葡萄糖溶液中和不同百分数乙醇-水溶液中EPI的荧光光谱图

为了证明EPI荧光强度的增强是由于EPI分子进入了β-CD空腔而非溶剂化效应的影响，作者用同样浓度的葡萄糖溶液代替β-CD溶液，在其他条件不变的情况下检测葡萄糖-EPI混合物的荧光强度(如图4e所示)，结果表明，相对于单独EPI溶液，混合物的荧光强度没有变化，荧光吸收峰没有移动且632 nm处无明显肩峰，这说明了EPI分子在亲水性环境中荧光发射峰以及荧光强度是不会发生变化的．为了进一步证实这个结论，所以作者用不同浓度的乙醇-水溶液代替不同浓度的β-CD溶液模拟为EPI的反应微环境，并监测混合物荧光强度变化，如图4(a～d)可知，随着乙醇在水溶液中的百分数的增加，混合物的荧光强度也相应地梯度增加且632 nm处的肩峰也变得更加明显，这与EPI在β-CD溶液中的荧光强度变化规律相似．由此说明了EPI分子在β-CD空腔中的微环境类似于在醇溶液中的微环境，这也进一步证明了EPI分子确实进入了β-CD的疏水空腔中．

2.4 包合常数的计算

在环糊精包合物中双曲线倒数法是一种典型的计算包合常数和确定包合比的有效方法[8]，为此本工作中用该方法计算β-CD与EPI的包合比和包合常数．

假设β-CD与EPI按2∶1的包合比进行反应时，方程式可简写为

(1)

此时的包合常数记为K，那么

K=[(β-CD)2-EPI]/[β-CD]2[EPI]

(2)

式中的[(β-CD)2-EPI], [β-CD]和[EPI]分别表示包合物(β-CD)2-EPI，主体(β-CD)，客体(EPI)的平衡浓度，K值的求得依赖于双倒数曲线公式

(3)

式中F是不同β-CD浓度下测得的EPI的荧光强度，F0和F∞分别是β-CD不存在时EPI的荧光强度和β-CD包合EPI达到饱和时的荧光强度，K为包合常数．

图5 荧光强度增量的倒数与β-CD浓度倒数的关系

2.5 包合物体外缓释

图6 不同pH值条件下EPI从β-CD空腔中缓释的百分含量与时间的关系

为了进一步证明包合物在临床应用上的价值，作者对其在体外的缓释做了初步探讨，如图6所示，由缓释曲线可知，释放初期(60 min内)，由于吸附在包合物表面的EPI的脱附，因此释放速率较快，5 h内累积释放速率达到一定值，此后随着释放时间的延长，EPI通过扩散作用持续向外释放，由于β-CD分子的保护作用，EPI分子从β-CD空腔中跑出来的速度相对缓慢，因此释放速率放缓，最后基本保持不变．

在药物释放的过程中，由于pH值的不同，药物从包合物中缓释的量随着时间的变化也有所不同，当pH分别为5和7.4时，5 h内EPI的累积释放率分别达到了36.1% 和26.1%．这正好为体内药物缓释提供了很好的参考，由于体内癌细胞周围的pH值约为5.0而正常细胞周围的pH值为7.4[9]，由此可预见药物在癌细胞周围的释放量要大于在正常细胞周围的释放量，这就有效增加了药物的靶向性和该包合物在临床应用上的价值和前景．

3 结论

实验发现β-CD包合EPI分子后改变了EPI分子周围的微环境，导致其疏水性增强，转动自由度减小，故荧光强度得到了很大的增强．pH值的不同，药物从包合物中缓释的速度也不同，该研究为EPI药物缓释以及提高其临床应用价值提供了很好的参考．

参考文献：

[1] GUO Y, GUO S, REN J,etal. Cyclodextrin functionalized graphene nanosheets with high supramolecular recognition capability: synthesis and host-guest inclusion for enhanced electrochemical performance[J]. ACS Nano, 2010, 4(7): 4001-4010.

[2] SANKARANARAYANAN R K, SIVA S, VENKATESH G,etal. Dual fluorescence of dothiepin, doxepin drugs-effect of solvents andβ-cyclodextrin[J]. J Mol Liq, 2011, 161(3): 107-114.

[3] CHEN Z, PIERRE D, HUA H,etal. Adsorption behavior of epirubicin hydrochloride on carboxylated carbon nanotubes[J]. Int J Pharm, 2011, 405(1-2): 153-161.

[4] JACOT W, PUJOL J L, CHAKRA M,etal. Epirubicin and ifosfamide in relapsed or refractory small cell lung cancer patients[J]. Lung Cancer, 2012, 75(2): 213-216.

[5] 唐进华, 刘 俊, 田 晶, 等. 两种方法治疗表柔比星化疗引起静脉炎的临床观察[J]. 现代肿瘤医学， 2008, 16(1): 160-160.

[6] MA-HAM A, WU H, WANG J,etal. Apoferritin-based nanomedicine platform for drug delivery: equilibrium binding study of daunomycin with DNA[J]. J Mater Chem, 2011, 21(24): 8700-8708.

[7] HERGERT L A, ESCANDAR G M. Spectrofluorimetric study of theβ-cyclodextrin-ibuprofen complex and determination of ibuprofen in pharmaceutical preparations and serum[J]. Talanta, 2003, 60(2-3): 235-246.

[8] CHAUDHURI S, CHAKRABORTY S, SENGUPTA P K. Encapsulation of serotonin inβ-cyclodextrin nano-cavities: Fluorescence spectroscopic and molecular modeling studies[J]. J Mol Struct, 2010, 975(1-3): 160-165.

[9] WANG C, CHENG L, LIU Z. Drug delivery with upconversion nanoparticles for multi-functional targeted cancer cell imaging and therapy[J]. Biomaterials, 2011, 32(4): 1110-1120.