溶菌酶提取试验的适宜条件探讨

徐 敏 (荆州职业技术学院生物工程系，湖北 荆州 434020)

溶菌酶提取试验的适宜条件探讨

徐 敏 (荆州职业技术学院生物工程系，湖北 荆州 434020)

利用离子交换树脂吸附法可以从鸡蛋清中提取溶菌酶。针对该试验方法的适宜条件进行了研究，结果表明，溶菌酶提取试验的适宜条件为：D152阳离子交换树脂中氢型树脂和钠型树脂为1∶1；每100ml蛋清中树脂液为25ml；吸附时间为6h；洗涤次数为3～4次；洗脱液浓度为10%；盐析浓度为32%。

阳离子交换树脂;溶菌酶；吸光度

溶菌酶是一种有效的抗菌剂，又称胞壁质酶或N-酰胞壁质聚糖水解酶，广泛存在于动物、植物及微生物体中。鸡蛋和哺乳动物的乳汁是溶菌酶的主要来源，其中以鸡蛋清中含量较高。由于离子交换树脂吸附法的操作过程简单且易于完成，因而一般采用该方法从鸡蛋清中提取溶菌酶，其中蛋白质含量(包括酶吸附量和杂蛋白含量)通过测定其吸光度值来确定。下面，笔者对溶菌酶提取试验的适宜条件进行探讨。

1 试验部分

1.1试验材料和仪器

1)试验材料 新鲜鸡蛋；D152阳离子交换树脂(荆州化工厂)；溶壁微溶壁微球菌(荆州微生物研究所)；硫酸铵、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、乙二胺四乙酸钠、丙酮等试剂(皆为国产分析纯)。

2)试验仪器 78-1磁力搅拌计(荆州仪表电机厂)；722型可见光栅分光光度计(沙市光学仪器厂)；GSY-2恒温水浴锅(北京市医疗设备厂)；2XZ-1旋片式真空泵(临海市精工真空设备厂)；DZF-250小型真空干燥器(郑州长城科工贸有限公司)。

1.2试验方法

1)蛋清的制备 将鸡蛋用20℃的蒸馏水洗净，在鸡蛋两端各敲一个小洞，使蛋清流出，搅拌2min使蛋清均匀(以不产生泡沫为宜)[1]，用4层纱布过滤后得到蛋清液。

2)吸附 将蛋清液放置冰箱中降温到5℃后，加入D152阳离子交换树脂并搅拌7h后静置。

3)洗脱 将上层清液倾出，下层树脂用等体积的去离子水清洗以除去吸附的蛋白质，然后过滤并重复清洗，再将树脂抽滤除去水分。把清洗好的树脂倒入到与树脂体积相等的硫酸铵溶液中进行洗脱，搅拌约半小时后，进行过滤，如此重复2次。

4)盐析 过滤抽干后，合并洗脱液，缓慢加入硫酸铵溶液，然后将混合物放入冰箱中静置，再离心过滤，将滤饼预冷到-10℃后用丙酮洗涤，离心分离后放入真空干燥箱，在35℃条件下干燥3h后即得到溶菌酶粗品。

2 试验结果与分析

2.1氢型和钠型树脂的比例

D152阳离子交换树脂包括氢型树脂和钠型树脂，2种树脂对蛋清pH的影响不同并导致试验结果产生差异[2]。D152阳离子交换树脂中氢型树脂和钠型树脂溶菌酶吸附量如下表1所示。

表1 D152阳离子交换树脂中氢型与钠型树脂的比例和溶菌酶吸附量的关系

由表1可以看出，当氢型树脂与钠型树脂的比例为1∶1时溶菌酶吸附量最大，因而确定D152阳离子交换树脂中氢型树脂和钠型树脂为1∶1。

2.2树脂用量

当树脂的用量不同时，测定树脂洗脱液吸光度,结果如表2所示(表中树脂用量以每100ml蛋清中含树脂液的体积表示)。

由表2可知，当每100ml蛋清中含树脂液的体积达到25ml后，溶液的吸光度不再增加，说明蛋清中已没有溶菌酶。考虑到经济适用性，试验中树脂用量以每100ml蛋清中含树脂液的体积为25ml为宜。

2.3吸附时间

蛋清的粘度较大，需以一定速度进行搅拌，这样有利于溶菌酶的吸附。在相同搅拌速度下，测定不同吸附时间的树脂洗脱液吸光度，结果表3所示。

表2 树脂用量和溶菌酶吸附量的关系

表3 吸附时间对溶菌酶吸附量的影响

由表3可知，当吸附时间小于6h时，随着吸附时间的增加，吸光度值增加，说明溶菌酶的吸附量增加；当吸附时间大于6h后，随着吸附时间的增加，吸光度值有所减小，说明溶菌酶的吸附量下降。因此，吸附时间以6h为宜。

2.3洗涤次数

表4 洗涤次数与杂蛋白含量的关系

进行离子交换树脂吸附试验时，离子交换剂除与蛋清中溶菌酶发生离子交换作用外，可能还会吸附某些杂蛋白，因而在洗脱前，将上层清液倾出后，对下层树脂需用去离子水清洗以除去杂蛋白。试验结果如表4所示。

由表4可知，随着洗涤次数增加，溶液里杂蛋白含量逐渐减少，当洗涤次数超过3次后溶液中杂蛋白含量很低。因此，确定洗涤次数为3～4次。

2.4洗脱液浓度

试验中采用一定浓度的硫酸铵溶液洗脱树脂上的溶菌酶，结果如图1所示。由图1可知，当硫酸铵溶液浓度达到10%后，树脂洗脱液的吸光度不再发生变化，说明树脂上的溶菌酶基本上被洗脱，考虑到经济适用的原则，确定洗脱液浓度为10%。

2.5盐析浓度

盐析时，当加入不同浓度硫酸铵时，其溶液的吸光度变化如图2所示。

由图2可知，当硫酸铵浓度为32%时吸光度最小，说明其溶液中溶菌酶吸附量最低。因此，确定盐析浓度为32%。

3 结 语

离子交换树脂吸附法提取鸡蛋清中溶菌酶的程序简洁，操作简单易于完成。针对该方法的适宜试验条件进行了研究，结果表明，溶菌酶提取试验的适宜条件为：D152阳离子交换树脂中氢型树脂和钠型树脂为1∶1；每100ml蛋清中树脂液为25ml；吸附时间为6h；洗涤次数为3～4次；洗脱液浓度为10%；盐析浓度为32%。

图1 洗脱液浓度对溶菌酶吸附量的影响 图2 硫酸铵浓度对溶菌酶吸附量的影响

[1]李建武.生物化学实验原理和方法[M].北京:北京大学出版社,1994.

[2]张珍田,陈良惠,宋贤一,等.利用超过滤法纯化鸡蛋白溶菌酶之研究[J].中国农业化学会志,1997,16(2):58-59.

10.3969/j.issn.1673-1409(N).2012.08.007

TQ464.8

A

1673-1409(2012)08-N019-02

2012-05-24

徐敏(1968-)，女， 1987年大学毕业，讲师，现主要从事生物化学方面的教学与研究工作。

[编辑] 李启栋