正交设计优选碎米糖化液的脱色工艺

石继连 刘文龙 杨岩涛 邓凯文 陈 锋 唐 昱 贺福元

1.湖南中医药大学药学院，中药药性与药效国家中医药管理局重点实验室，湖南长沙 410208；2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南长沙 410007

正交设计优选碎米糖化液的脱色工艺

石继连1刘文龙1杨岩涛1邓凯文2陈 锋1唐 昱1贺福元1

1.湖南中医药大学药学院，中药药性与药效国家中医药管理局重点实验室，湖南长沙 410208；2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南长沙 410007

目的 优选碎米糖化液脱色的最佳工艺条件。方法 以活性炭为脱色剂，在单因素基础上进行正交试验，对碎米糖化液进行活性炭用量、加热温度和脱色时间等因素的考察，以葡萄糖保留率和脱色率为指标，选择最佳工艺。结果 碎米糖化液活性炭脱色的最佳工艺为：糖化液加入3%的活性炭后，在70℃下脱色40 min。 结论 本文所建立的脱色工艺简单可行，可为进一步制备注射用葡萄糖的脱色工艺研究提供实验依据。

碎米；糖化液；葡萄糖；脱色；工艺；正交设计

注射用葡萄糖原料多以玉米为原料加工制备而成，用碎米制备注射用葡萄糖可以提高其深加工附加值。碎米制备注射用葡萄糖的过程中，其糖化液含有色素等杂质需要除去。目前，对碎米制备注射用葡萄糖的研究尚未见报道，更未见碎米糖化液的活性炭脱色工艺的研究报道。本文采用活性炭对糖化液进行脱色，在单因素的基础上进行正交试验，考察活性炭用量、加热温度及时间等因素，以期探索糖化液脱色的最适宜条件，为进一步制备注射用葡萄糖的脱色工艺研究提供实验依据。

1 仪器与试药

1.1 材料

糖化液（自制），活性炭（台山市化工厂有限公司，批号：20090401，分析纯），D-无水葡萄糖对照品（中国药品生物制品检定所，批号：1108334-200503）。乙腈为色谱纯，流动相用水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器

Waters1525高效液相色谱仪（Waters 2410示差折光检测

器及Breeze色谱工作站），TU-1900双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司），AR1140/C分析天平（瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司）。

2 方法与结果

2.1 葡萄糖含量及葡萄糖保留率的测定

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取D-无水葡萄糖对照品适量，置50 mL容量瓶中，加水溶解，定容至刻度，摇匀制成浓度为75 mg/mL的对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 将糖化液置具塞锥形瓶中，在60℃下水浴30 min（不断振摇），取出，冷却至室温，以滤纸抽滤，滤液以0.45 μm微孔滤膜过滤，得供试品溶液。

2.1.3 阴性溶液的制备 将超纯水以0.45 μm微孔滤膜过滤，得阴性溶液。

2.1.4 色谱条件 色谱柱为UltimateXB-WH2柱（250mm×4.5mm，2.5 μm）；流动相为乙腈∶水（65∶35）；流速为 1 mL/min；柱温为30℃；检测波长为209 nm；进样量为10 μL，理论塔板数按葡萄糖计不低于4 500。

2.1.5 标准曲线的制备 分别精密量取1 mL葡萄糖对照品溶液置 2、5、10、25、50 mL 容量瓶中， 加超纯水稀释至刻度，制成浓度为 37.5、15.0、7.5、3.0、1.5 mg/mL 的溶液，分别吸取 10 μL注入高效色谱仪中，测定峰面积，以峰面积为纵坐标（Y），相应的浓度为横坐标（X），绘制标准曲线，回归方程为 Y=71 346X+43 892，r=0.999 7，表明葡萄糖浓度在 1.5～37.5 mg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系。见图1。

图1 阴性对照溶液、对照品溶液、供试品溶液HPLC色谱图

2.1.6 精密度试验 取对照品溶液连续进样测定6次，分别测定其峰面积，计算RSD为1.16%，表明仪器精密度良好。

2.1.7 稳定性试验 取同一供试品溶液， 分别于0、2、4、8、12、24 h后测定峰面积，计算RSD为2.72%，结果表明供试品在24 h内稳定性良好。

2.1.8 重复性试验 取同一批糖化液6份，按“2.1.2”项下的方法制成供试品溶液，按“2.1.5”项下的方法测定其峰面积，计算RSD为2.07%，表明溶液有较好的重复性。

2.1.9 加样回收率试验 精密量取已知含量的糖化液9份，分别精密加入80%、100%和120%的葡萄糖对照品各3份，按“2.1.2”项下的方法制成供试品溶液，按“2.1.5”项下的方法测定其峰面积，计算葡萄糖的平均加样回收率为98.76%，RSD为2.07%。

2.1.10 葡萄糖保留率的测定 取脱色后的糖化液测定其葡萄糖含量，与未经活性炭脱色品比较，计算其葡萄糖保留率。保留率（%）=（脱色后葡萄糖含量/脱色前葡萄糖含量）×100%。

2.2 色素吸光度的测定[1]

将滤纸过滤后的糖化液进行全波长扫描，结果表明，糖化液在254 nm处有最大吸收，故选择此波长为检测波长，测定糖化液的吸光度，用蒸馏水作空白液，在254 nm处测定脱色后的吸光度。脱色率（%）=[（脱色前色素吸光度-脱色后色素吸光度）/脱色前色素吸光度]×100%。

2.3 正交试验设计

在单因素实验考察的基础上，选取活性炭用量、加热温度及脱色时间等主要因素进行正交试验，进一步优选其脱色工艺条件，因素水平的设计见表1。精密量取糖化液100 mL共9份，分别置于250 mL锥形瓶中，加入一定量的活性炭（按糖化液的固形物含量比例计），在一定的温度下水浴脱色一定的时间，不断振摇，过滤后，分别照“2.1”和“2.2”项下的方法测定葡萄糖保留率及脱色率。结果见表2，方差分析结果见表3。

表1 因素水平表

表2 正交试验设计表及结果

表3 方差分析结果

由方差分析结果可知，因素A对综合指标的影响有显著性（P＜0.05），结合其极差分析，选取 A2水平；B、C对指标影响均无显著性，但结合单因素考察结果、极差分析结果及生产实际情况，B和C因素均选取水平2。综合分析，确定出糖化液的脱色较优工艺条件是A2B2C2，即糖化液加入3%的活性炭后，在70℃下脱色40 min。

2.4 验证试验

按上述较优工艺条件制备3批样品，进行工艺验证，结果葡萄糖的平均保留率为94.76%，RSD为1.83%；平均脱色率为96.39%，RSD为2.16%。可见按优化工艺进行脱色，葡萄糖的保留率及脱色率均取得较理想的结果，表明该工艺合理、稳定、可行。

3 讨论

在医药生产中常见的脱色剂有活性炭、双氧水、DEAE纤维素、大孔树脂及离子交换树脂等，其中活性炭的脱色能力和生产成本等性价比，在糖化液的脱色生产中是相对最高的，且不会影响产品的化学性质，故本研究采用活性炭作为糖化液的脱色剂。目前测定葡萄糖含量的方法有化学法、气相色谱法、离子色谱脉冲安培法、毛细管电泳电化法、液相色谱蒸发光散射检测法等。但这些方法具有操作繁琐、测量结果难判定、检测仪器价格昂贵、专用性强、普及程度不高等缺点[2]。高效液相色谱法虽已有报道[2-5]，但经多次预试发现这些条件均对本研究中糖化液样品的分离效果较差而改用本文所述方法。

笔者在前期进行过单因素实验，分别考察了活性炭用量、糖化液的pH值、加热温度及加热时间等4个主要影响因素，发现其中活性炭的用量对葡萄糖的保留率及脱色率影响最显著，其余因素影响相对较小。考虑到为了制备纯度高的注射用葡萄糖原料，在脱色过程中不宜再加入酸、碱等新杂质调整糖化液的pH值，故本实验不再考虑本来影响脱色效果较小的因素pH值，进一步考察研究其余3个因素对糖化液脱色效果的影响大小，对其脱色工艺条件初步优化。为此，本研究已申请专利（申请号为201010547831.2）。

若制备注射用葡萄糖，还需深入细致研究，结合吸附蛋白质的情况，采用精度和预测性更好的星点设计-效应面法[6]优化，可取得最佳脱色工艺条件。结合后续的去离子工序后进行的第2次脱色研究，可进一步纯化葡萄糖，并可将第2次脱色所用的活性炭充分利用到第1次脱色过程中，也可大大节约生产成本。

[1]周鸿立，吴德恒，董卫权，等.玉米须多糖脱色工艺条件的研究[J].上海中医药杂志，2010，44（4）：76.

[2]林长钦，李颖怡，刘垚.高效液相色谱示差法测定蜂蜜中的果糖、葡萄糖、蔗糖[J].广东农业科学，2010，37（4）：254-256.

[3]张书芬，史萍萍，王全林，等.液相色谱示差折光法测定蜂蜜中的果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖[J].食品科学，2008，29（6）：280-283.

[4]宋更申，姜建国，孙婷.HPLC法测定葡萄糖氯化钠注射液中葡萄糖的含量[J].中国药房，2010，21（1）：74.

[5]王浩，刘艳琴，杨红梅，等.液相色谱-质谱联用技术测定无糖食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖[J].分析化学，2010，38（6）：873-876.

[6]陆刚，杜国栋，王俊儒，等.星点设计-效应面法优化丹参须根有效成分的酶法提取工艺[J].中国中药杂志，2008，33（16）：1976.

Optimization of decoloration technology of saccharification liquid from broken rice by orthogonal design

SHI Jilian1LIU Wenlong1YANG Yantao1DENG Kaiwen2CHEN Feng1TANG Yu1HE Fuyuan1
1.School of Pharmacy,Hu′nan University of Chinese Medicine,the Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine in Medicinal Properties and Efficacy of the State Administration of Traditiomal Chinese Medicine,Hu′nan Province,Changsha 410208,China;2.The First Affiliated Hospital of Hu′nan University of Chinese Medicine,Hu′nan Province,Changsha 410007,China

ObjectiveTo optimize the decoloring technology conditions of saccharification liquid from broken rice.MethodsTaking the active carbon as decoloring agents,the orthogonal experiments was performed on the single factor basis,with the purpose of investigation in the active carbon dosage,heating temperature and decoloring time of saccharification liquid from broken rice,glucose reserve rate and the decoloring rate were taken as the indexes to optimize the discolored technology.ResultsThe optimum decoloring conditions of saccharification liquid from broken rice was 3%active carbon,with decoloring of 40 min under 70℃.ConclusionThe decoloring technology is simple,practicable and available.It can provide experimental basis for the further decoloring technology research on the glucose injection.

Broken rice;Saccharification liquid;Glucose;Decoloration;Technology;Orthogonal design

TQ461

A

1673-7210（2012）01（c）-0117-03

湖南省科技厅科研课题（项目编号：2010SK3019）。

石继连（1973-），男，汉族，湖南会同人，副教授，硕士生导师，执业药师；研究方向：中药炮制与制剂。

贺福元（1965-），男，汉族，湖南祁东人，博士后，教授，博士生导师；研究方向：遗传中药药理学、谱动学、谱效学、谱效动力学、谱量学、中药药剂学及中医药信息数学。

2011-09-14 本文编辑：卫 轲）