新型[1,2,4]三唑[4,3-b]均四嗪类化合物的合成及其抗癌活性

陈 辉, 郑彩霞， 杨玉峰， 林婷婷， 袁 栋， 徐 峰

(台州职业技术学院 生物与化学工程学院,浙江 台州 318000)

均四嗪类化合物具有较多生理活性，如抗炎[1]、镇痛[2]、抗病毒[3]及抗菌[4]。均四嗪的衍生物一般分为三类，即1,4-二氢，1,2-二氢和1,6-二氢均四嗪。近年来发现二氢均四嗪类化合物具有抗癌活性而引起人们关注。胡惟孝等[5]发现3，6-二苯基-1,4-二氢-1，4-二甲酰胺均四嗪类化合物具有很强的抗癌活性，其中N，N′-二间甲基苯胺-3，6-二甲基-1，4-二氢均四嗪-1，4-二甲酰胺对小鼠白血病细胞P-388,人实体瘤细胞肝癌BEL-7402，乳腺癌MCF-7和肺腺癌A-549均有较强的增殖生长抑制作用；饶国武等[6]发现3，6-二苯基-1，2-二氢均四嗪类化合物具有较强的抗癌活性,其中1-氯乙酸酰基-3，6-苯基-1，2-二氢均四嗪对P-388和A-549具有较强的抗癌能力。但至今为止，1，6-二氢均四嗪衍生物的抗癌活性研究还未见文献报道。

Scheme1

本文以3-(3,5-二甲基吡唑-1-基)-6-肼基均四嗪(1)和芳醛(2a～2f)为原料，经Schiff碱缩合和环合反应合成了6个新型的6-芳基-3-(3,5-二甲基吡唑-1-基)[1,2,4]三唑[4,3-b]均四嗪(4a～4f， Scheme 1)，其结构经1H NMR， MS， IR和元素分析表征。以顺铂为对照，采用四氮唑盐还原法(MTT法)测试了体外4a～4f对人白血病细胞株HL-60， A-549， MCF-7和人子宫颈癌细胞株Hela的抗癌活性。结果表明，4a～4f均具有较强的体外抗癌活性。

1 实验部分

1．1 仪器与试剂

XRC-1型熔点仪(温度未经校正)；Brucker AC400(400 MHz)型核磁共振仪(DMSO-d6为溶剂，TMS为内标)；Nicolex FI-IR-170型红外光谱仪(KBr压片);HP 5989A型质谱仪。

HL-60， A-549， MCF-7和Hela,中国科学院上海生命科学院细胞库；DMEM培养基，Gibco； MTT， Sigma(上海实生细胞生物技术有限公司分装)；胎牛血清，青霉素-链霉素，EDTA-胰酶消化液，Gibco；顺铂，齐鲁制药有限公司产品(产品批号1010011DC)；其余所用试剂均为分析纯。

1.2 合成

(1) 3a～3f的合成(以3a为例)

在反应瓶中加入1 1.0 g(4.85 mmol)的无水乙醇(20 mL)溶液，搅拌下于室温滴加苯甲醛(2a)0．5 g(4.85 mmol)的无水乙醇(10 mL)溶液，滴毕，反应至终点(TLC跟踪，展开剂：乙酸乙酯)。抽滤，滤饼干燥得砖红色固体1-苯基亚甲基-2-[6-(3,5-二甲基-1H-吡唑-1-基)-1,2,4,5-四嗪-3-基]肼(3a),产率，58.0%， m.p.198 ℃～200 ℃；1H NMRδ: 12.59(s, 1H), 8.37(s, 1H), 7.78(d,J=6.6 Hz， 2H), 7.44～7.49(m, 3H), 6.24(s, 1H), 2.47(s, 3H), 2.25(s, 3H)； IRν： 3 217, 3 053, 1 606, 1 485, 1 419 cm-1； MSm/z： 295{[M+H]+}。

用类似的方法合成3b～3f,其表征数据[7]与Scheme 1预期吻合。

(2)4a～4f的合成(以4a为例)

在反应瓶中加入3a1．5 g(4．5 mmol)和氯仿30 mL，搅拌下加入四醋酸铅2.5 g(5.7 mmol)的氯仿(10 mL)溶液，回流反应30 min(溶液变成棕黄色)。冷却至室温，减压抽除溶剂，加入无水乙醇，析出大量固体，冷却至0 ℃，抽滤，滤饼干燥后用无水乙醇重结晶得深黄色固体3-(3,5-二甲基-1H-吡唑-1-基)-6-苯基-[1,2,4]三唑[4,3-b]均四嗪(4a)。

用类似的方法合成黄色固体4b～4d, 4f和棕黄色固体4e。

1．3 抗癌活性测试

以顺铂为对照，采用MTT法测定4a～4f对HL-60， A549， MCF-7和Hela的体外抗癌活性。顺铂和4(1 mg)用DMSO(20 μL)溶解；取2 μL用1 000 μL培养液稀释，使浓度(c)为100 μg·mL-1,再用培养液连续稀释至使用浓度;每1 000 mL培养基中含80万单位青霉素，1.0 g链霉素,10%灭活胎牛血清;将肿瘤细胞接种于培养基中,置37 ℃, 5%CO2培养箱中培养，3 d～5 d传代。

将癌细胞用EDTA-胰酶消化液消化，并用培养基稀释成1.0×105·mL-1,加到96孔细胞培养板中，每孔100 μL，置37 ℃， 5%CO2培养箱中培养。接种24 h 后，倾去培养基，加入用培养基稀释的样品，每孔 200 μL，每个浓度加3孔，置37 ℃， 5%CO2培养箱中培养72 h后在细胞培养孔中加入5 mg·mL-1的MTT，每孔10 μL，置37 ℃孵育3 h;加入DMSO,每孔150 μL,用振荡器振荡，使甲臢完全溶解，用酶标仪于490 nm处测OD值,计算细胞生长抑制率{抑制率/%=[1-(OD药物-OD空白)/(OD对照-OD空白)]×100%},根据细胞生长抑制率，以直线回归方法计算IC50值。以同样条件用不含样品，含同样浓度DMSO的培养基培养的细胞作为对照，计算样品对肿瘤细胞生长的半数致死浓度(IC50)。

表1 4的实验结果和MS数据Table 1 Experimental results and MS data of 4

表2 4的1H NMR和IR数据Table 2 1H NMR and IR data of 4

2 结果与讨论

2．1 合成

合成4时，缩合剂可用四醋酸铅，也可用甲磺酸和对甲苯磺酸等磺酸类催化剂，效果均较好。合成4的实验结果和表征数据分别见表1和表2。从表1可见，当苯环上的取代基为吸电子基(2b～2d,2f)时，产物的颜色为亮黄色，且收率较高(56.5%～73.2%)；当苯环上的取代基为电子基(2e)或无取代基(2a)时，产物的颜色相对较深，收率也较低(31.3%～40.6%)， 4e还极易吸潮发黏。

2．2 抗癌活性

4的抗癌活性结果见表3。由表3可见，4a～4f对四种癌细胞均具有较强的抑制活性，其中4a对HL-60的活性(IC50=3.54 μg·mL-1)约为顺铂(IC50=6.65 μg·mL-1)的2倍； 4b抑制A-549的活性(IC50=2.70 μg·mL-1)与顺铂(IC50=2.62 μg·mL-1)相当；在抑制MCF-7时， 4a～4f的活性(IC50=1.09 μg·mL-1～6.36 μg·mL-1)明显好于或相当于顺铂(IC50=6.38 μg·mL-1)；另外，4a～4f虽然显示了较好的抑制Hela的活性(IC50=1.05 μg·mL-1～6.91 μg·mL-1)，但比顺铂(IC50=0.58 μg·mL-1)略显逊色。

表3 4的抗癌活性Table 3 Anti-cancer activities of 4

[1] Lang J S A, Johnson B, Cohen L E,etal. Aryl-s-tetrazines with anti-inflammatory activity[J].J Med Chem,1976,19(12):1404-1409.

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[6] Rao G W， Hu W X. Synthesis,structure analysis,and antitumor activity 3,6-disubstituted-1,4-dihydro-1,2,4,5-tetrazine derivatives[J].Bioorg Med Chem Let,2006,12:3702-3705.

[7] 3b:绛红色固体,产率42.1%， m.p.204 ℃～207 ℃；1H NMRδ: 12.60(s, 1H), 8.36(s, 1H), 7.84(q,J=8.8 Hz, 5.6 Hz， 2H), 7.32(t,J=8.8 Hz， 2H), 6.24(s, 1H), 2.50(s, 3H), 2.47(s, 3H)； IRν： 3 222, 3 036, 1 606, 1 572, 1 423 cm-1； MSm/z： 313({[M+H]+}． 3c：桔红色固体,产率84.3%， m.p.229 ℃～230 ℃；1H NMRδ: 12.82(s, 1H), 8.69(s, 1H), 8.07(d,J=8.6 Hz， 1H), 7.75(s, 1H), 7.55(d,J=8.6 Hz， 1H), 6.24(s, 1H), 2.50(s, 3H), 2.25(s, 3H)； IRν： 3 222, 3 065, 1 573, 1 485, 1 421 cm-1； MSm/z： 363{[M+H]+}. 3d：鲜红色固体，产率98.0%， m.p.220 ℃～222 ℃；1H NMRδ: 12.91(s, 1H), 8.45(s, 1H), 8.32(d,J=8.8 Hz， 2H), 8.04(d,J=8.8 Hz， 2H), 6.26(s, 1H), 2.50(s, 3H), 2.26(s, 3H)； IRν： 3 257, 3 022, 1 523, 1 485, 1 428 cm-1； MSm/z： 340{[M+H]+}. 3e:暗红色固体,产率83.2%, m.p.198 ℃～200 ℃；1H NMRδ: 12.45(s, 1H), 8.31(s, 1H), 7.72(d,J=8.8 Hz， 2H), 7.04(d,J=8.8 Hz， 2H), 6.23(s, 1H), 3.82(s, 3H), 2.45(s, 3H), 2.25(s, 3H)； IRν： 3 230, 3 062, 1 513, 1 488, 1 424 cm-1； MSm/z： 325{[M+H]+}． 3f:桔黄色固体,产率90.4%. m.p.215 ℃～217 ℃；1H NMRδ: 12.77(s, 1H), 8.76(s, 1H), 8.07(d,J=9.6 Hz， 1H), 7.56(s,J=9.6 Hz， 1H), 7.46(m, 2H), 6.25(s, 1H), 2.51(s, 3H), 2.25(s, 3H)； IRν： 3 210, 3 055, 1 540, 1 458, 1 420 cm-1； MSm/z： 328{[M+H]+}.