肺康饮口服液对Ncl-H446细胞生长及凋亡的影响

罗 强 孙 黎 张淑萍 李 旺 张林西 (河北北方学院实验中心，河北 张家口 075000)

肺康饮口服液对Ncl-H446细胞生长及凋亡的影响

罗 强 孙 黎 张淑萍1李 旺1张林西 (河北北方学院实验中心，河北 张家口 075000)

目的 通过观察肺康饮口服液对人小细胞肺癌Ncl-H446生长及凋亡的影响，探讨其体外的抗肿瘤效应。方法 体外培养Ncl-H446细胞，以不同浓度的肺康饮口服液作用为实验组，并设对照组，CCK8法测细胞增殖抑制效应、透射电镜观察药物对细胞形态学的影响，流式细胞术检测Ncl-H446细胞凋亡。结果 不同浓度肺康饮口服液作用Ncl-H446细胞24 h增殖抑制明显(P＜0.05)，其抑制效应具有剂量依赖的特点;电镜及流式显示Ncl-H446细胞凋亡。结论 肺康饮口服液可抑制Ncl-H446细胞的生长且增殖抑制效应具有剂量依赖性，并可诱导肿瘤细胞凋亡。

肺康饮口服液;Ncl-H446;CCK-8

肺癌是目前公认的全球发病率最高的恶性肿瘤之一，而且其较高的死亡率和较低的治愈率一直以来都是临床较难攻克的一道难题〔1〕。小细胞肺癌常见于老年人，是一种全身性疾病，治疗以化疗为主，但老年患者由于特殊的身体条件，不能耐受常规剂量的化疗，目前对于老年人小细胞肺癌的治疗，文献报道仍存在分歧〔2，3〕。肺癌按组织病理分型主要分为小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)，其中SCLC的癌细胞体积虽然很小，但是，却是各类肺癌中恶性程度最高、预后极差的一种〔4〕。有很多研究发现肿瘤耐药性的产生通常都伴有凋亡抑制现象〔5〕。肺康饮是由竹叶、桑叶等数位中药组成的中药复方，经临床观察对肺癌患者有一定的疗效〔6〕，但作用机制还不清楚。为此本研究主要通过肺康饮口服液对人小细胞肺癌增殖与凋亡作用来探讨其作用机制并为肺康饮口服液进一步研究开发与临床治疗提供新的依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

人小细胞肺癌细胞株Ncl-H446由协和医科大学遗传室惠赠。DMEM培养基(Gibco公司)，胎牛血清(天津市川页生化制品有限公司)，CCK-8(上海同仁化学)，琼脂糖、100 bp DNA marker(北京六和同公司)，细胞周期试剂盒(美国BD公司)。美国SpectraMax M2e多功能微孔板检测系统，美国 FACSA ria流式细胞仪，日本电子100CS-Ⅱ型透视电镜，LKB-Ⅲ型超薄切片机。

1.2 肺康饮口服液的制备

肺康饮口服液按水煎醇沉法制备而成，生药含量为1 g/ml，pH7.0，以0.22 μm微孔滤器过滤除菌，分装4℃保存。使用时以培养液稀释至所需药物浓度。

1.3 Ncl-H446细胞培养

培养基，37℃、5%CO2条件下培养。取对数生长期细胞用不同浓度肺康饮口服液处理。

1.4 CCK-8法检测细胞增殖抑制

取对数生长期密度为5×104/ml的Ncl-H446细胞，接种于 96孔培养板，100 μl/孔。用DMEM培养液将肺康饮口服液稀释成2.379，1.586，1.269，0.793，0.476 mg/ml 5个不同浓度，分别加入96孔培养板(100 μl/孔)，每组设4个复孔，对照组加入等体积培养液，置37℃、5%CO2培养24 h。然后每孔加入CCK-8 20 μl继续培养4 h，之后用SpectraMax M2/M2e多功能微孔板检测系统测吸光度(A490值)，按公式计算细胞抑制率;抑制率(%)=(1-实验组平均A490值/对照组平均A490值)×100%。

1.5 电镜观察细胞形态及凋亡情况

细胞(密度为1×106/ml)分别接种于4个50 ml的培养瓶中，贴壁后换不同浓度的肺康饮口服液培养液(0.793，1.269，1.586 mg/ml)、并设对照，作用5 h后，收集细胞，常规固定、脱水、包埋、切片、染色，进行透射电镜观察。

1.6 流式细胞仪检测凋亡细胞

取处于对数生长期的Ncl-

取对数生长期Ncl-H446

细胞用含10%胎牛血清的DMEM H446细胞，加入上述不同浓度肺康饮口服液培养24 h后，消化细胞，制成单细胞悬液，1 000 r/min离心7 min，PBS洗涤2次，配成1×106/ml细胞悬液，70%冰乙醇-20℃固定，上机测定前，离心去乙醇，用PBS洗涤2次，用0.5 ml PBS悬浮细胞制成细胞悬液，加入PI染液0.5 ml，4℃避光染色30 min，上流式细胞仪检测凋亡情况。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 肺康饮口服液对Ncl-H446细胞增殖的影响

CCK-8法检测 2.379，1.586，1.269，0.793，0.476 mg/ml 5 个不同浓度的肺康饮口服液作用Ncl-H446细胞24 h，对 Ncl-H446细胞的生长有不同程度的抑制作用，并随着肺康饮口服液浓度的增加，对Ncl-H446细胞抑制率也增加，分别为11.28%、21.00%、52.62%、68.00%、78.45%。其增殖抑制效应具有明显的量效关系(P＜0.05)。见表1。

2.2 细胞形态学观察

对照组肺癌细胞表面有很多微绒毛，胞质内有较丰富的细胞器，如线粒体、粗面内质网、核糖体等清晰可见。核圆形，核膜清晰，核内染色质呈细沙粒状，异染色至少。核仁大;给药组细胞膜结构发生变化，核体积变小，染色体边集合膜下，核膜清晰，细胞内膜结构呈凋亡早期的改变，部分坏死细胞膜断裂，细胞内膜结构消失，胞质内被大量脂滴所充填，少量细胞核固缩形成高电子斑块边集合膜下，细胞表面伸出长的突起，细胞内膜结构为凋亡晚期的改变。见图1。

表1 肺康饮口服液对Ncl-H446细胞增殖的影响

图1 不同浓度的肺康饮作用小细胞肺癌后，电镜下细胞形态学的改变(×5 800)

2.3 肺康饮口服液对Ncl-H446细胞周期的影响

1.586、1.269、0.793、0.476 mg/ml肺康饮口服液处理的 Ncl-H446细胞，均出现一个亚二倍体的凋亡峰，其峰值(即凋亡细胞的细胞数与总细胞数的比值)随肺康饮口服液浓度增高逐渐增高，其峰值分别为 5.53%、7.12%、10.34%、21.14%及29.68%。对照组无亚二倍体凋亡峰。

经2.379、

3 讨论

小细胞肺癌占全部肺癌的20%左右，远期疗效不佳。虽然化疗是治疗该病的主要手段之一，但有关老年人小细胞肺癌治疗的研究报道不多，常被排除在治疗和研究之外〔7，8〕。小细胞肺癌为中老年疾病，尤以老年人多见，随着世界人口老龄化趋势的加重，老年小细胞肺癌的发病率也呈上升趋势〔9〕。从细胞动力学观点看，该型肺癌生长迅速，倍增时间短〔10〕。

肿瘤的发生有其遗传物质基础，主要表现为多基因突变所致的细胞失控性生长，细胞增殖失控和细胞凋亡受阻是其发生、发展的主要原因〔11〕。细胞凋亡或称程序性细胞死亡(PCD)，即有核细胞在一定条件下启动自身的内部机制使得内源性DNA内切酶激活而引起的细胞死亡过程，即受基因、信使调控的单个细胞自杀过程〔12〕。细胞凋亡有别于坏死细胞主动性自杀，是受多基因控制的有序性死亡过程。诱导肿瘤细胞凋亡和进一步阐明凋亡的基因调控机制，是目前肿瘤治疗新的研究热点〔13〕。凋亡最突出的生化特征是内源性Ca2+/Mg2+依赖性核酸内切酶的活化在和小体连接区切割DNA双链，使DNA降解成200 bp或其整数倍的寡核苷酸片段。细胞出现凋亡时，出现明显的核固缩、凝聚、断裂，膜出泡，形成凋亡小体;经流式细胞仪DNA定量分析图出现显著的细胞凋亡峰。目前所发现的能够诱导细胞凋亡的西药很多，但由于毒副作用较大而应用受到一定限制，因此中药诱导肺癌细胞凋亡受到越来越多的关注〔14〕。

肺康饮口服液作为常见的损伤性诱导因子诱导肿瘤细胞凋亡其主要作用是引起CD4+细胞、CD8+细胞的缺失，阻断部分蛋白酶的活化或者抑制它们的功能〔15，16〕。为阐明肺康饮口服液的抗肿瘤作用机制，本研究采用透射电镜镜形态学观察、流式细胞术检测Ncl-H446细胞凋亡特征，从而证实肺康饮口服液抗肿瘤细胞(Ncl-H446)机制是诱导其凋亡。实验中CCK-8法检测结果显示肺康饮口服液作用Ncl-H446细胞的增殖抑制作用存在明显的量效关系，且随着浓度增加抑制率明显增强。

1 Collins LG，Haines C，Perkel R，et al.Lung cancer：diagnosis and managemen〔tJ〕.Am Fam Physician，2007;75(1)：56-63.

2 Caseinu S，Del Ferro E，Ligi M，et al.The clinical impact of teniposide in the treatment of elderly patients with small-cell lung cancer〔J〕.Am J Clin Oncol，1997;20(5)：477.

3 Tebbutt NC，Snyder RD，Burns WI.An analysis of the outcomes of treat-ment of small cell lung cancer in the elderly〔J〕.Aust NZJ Med，1997;27(20)：160.

4 Johnson BE，Grayson J，Makuch RW，et al.Ten-year survival of patients with small cell lung cancer treated with combination chemotherapy with or without irradiation〔J〕.Clin Oncol，1990;8：396-401.

5 赵建清，李 旺，张淑萍，等.肺康饮联合化疗治疗晚期非小细胞肺癌临床疗效观察〔J〕.中药药理与临床，2006;22(5)：27.

6 Lockhart C，Berlin JD.The epidermal growth factor receptor as a target for colorectal cancer therapy〔J〕.Semin Oncol，2005;32(1)：52-60.

7 De Rijke JM，Schouten LJ，Schouten HC，et al.Age-specific differences in the diagnostics and treatment of cancer patients aged 50 years and older in the province of limburg，The Netherlands〔J〕.Ann Oncol，1996;7(7)：677-85.

8 Shepherd FA，Bezjak A.老年小细胞肺癌的治疗.见：冯玉麟，刘春涛.肺癌〔M〕. 北京：人民卫生出版社，2002：996-1003.

9 彭培建，林 忠，张红雨，等.厄罗替尼治疗晚期非小细胞肺癌患者的疗效及安全性研究〔J〕.中国全科医学，2010;13(5)：1420.

10 查人俊，何长清，曾狄文，等.现代肺癌诊断与治疗〔M〕.第2版.北京：人民军医出版社，1999：161-5.

11 Waggoner SE.Cervical cancer〔J〕.Lancet，2003;361：2217-25.

12 Blagosklonny MV.Prospectine strategies to enforce selectively cell death in caner cells〔J〕.Oncogene，2004;23：2967.

13 Dunne AL，Price ME，Mothersill C，et al.Relationship between clonogenic radiosensitivity，radiation-induced apoptosis and DNA damage/repair in human colon cancer cells〔J〕.Br J Cancer，2003;89：2277-83.

14 赵建平，王媛媛.人参多糖体外诱导人非小细胞肺癌A549细胞凋亡的实验研究〔J〕.中国中西医结合杂志，2006;26(1)：95.

15 Keller P，Schaumburg F，Fischer SF，et al.Direct inhibition of cytochrome c-induced caspase activation in vitro by Toxoplasma gondii reveals novel mechanisms of interference with host cell apoptosis〔J〕.FEMS Microbiol Lett，2006;258：312-9.

16 Luder CG，Gross U.Apoptosis and its modulation during infection with Toxoplasma gondii：molecular mechanisms and role in pathogenesis〔J〕.Curr Top Microbiol Immunol，2005;289：219-37.

Effects of Feikangyin oral liquid on growth and apoptosis of Ncl-H446 cells

LUO Qiang，SUN Li，ZHANG Shu-Ping，et al.
Central Laboratory，Hebei North University，Zhangjiakou 075000，Hebei，China

Objective To observe the Feikangyin oral liquid on growth and apoptosis of Ncl-H446 and explore the anti-tumor effect in vitro.Methods Ncl-H446 cells were cultured in vitro with different concentrations of Feikangyin in experimental and the control groups.Cell proliferation was measured by CCK8 method.Cell morphology was observed by transmission electron microscopy.Flow cytometry was used to detect the protein expression in Ncl-H446 cells.Results Effects of different concentration of Feikangyin at 24 h on Ncl-H446 cell growth inhibition were significant(P＜0.05)，and the inhibitory effect had a dose-dependent characteristics.Flow cytometry and transmission electron microscopy showed that Feikangyin could induce Ncl-H446 cells apoptosis.Conclusions Feikangyin could inhibit the growth of Ncl-H446 cells，the inhibition has a dose-dependent，could induce tumor cell apoptosis.

Feikangyin;Ncl-H446;CCK-8

R393

A

1005-9202(2012)23-5206-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.23.047

河北省科技厅项目(No.062761618)

1 河北北方学院中医教研室

罗 强(1977-)，男，实验师，主要从事细胞生物学研究。

〔2011-05-26收稿 2012-01-10修回〕

(编辑 曹梦园)