RP-HPLC法测定注射用重组人B淋巴细胞刺激因子受体-抗体融合蛋白的含量

姚雪静，李壮林（烟台荣昌生物工程有限公司，山东烟台 264006）

RP-HPLC法测定注射用重组人B淋巴细胞刺激因子受体-抗体融合蛋白的含量

姚雪静＊，李壮林（烟台荣昌生物工程有限公司，山东烟台 264006）

目的：建立测定注射用重组人B淋巴细胞刺激因子受体-抗体融合蛋白（简称TACI-Fc）含量的方法。方法：采用反相高效液相色谱法。色谱柱为Vydac C18，流动相A液为含0.1%三氟乙酸的水溶液，流动相B液为含0.1%三氟乙酸的乙腈溶液，梯度洗脱，流速为1.3mL·min－1，检测波长为280nm。结果：TACI-Fc进样量在5.0～20.0µg范围内与峰面积积分值呈良好线性关系（r＝0.9997）；方法平均回收率为99.71%，RSD＝1.14%（n＝9）。结论：本方法操作简便、重复性好、结果准确，适用于测定注射用TACI-Fc的含量。

反相高效液相色谱法；重组人B淋巴细胞刺激因子受体-抗体；融合蛋白；含量

重组人B淋巴细胞刺激因子受体-抗体融合蛋白是将人B淋巴细胞刺激因子的受体TACI（一种穿膜蛋白活化物）的胞外特定可溶性部分，与人IgG1的Fc部分构建成的融合蛋白（以下简称TACI-Fc），用于类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病的治疗[1～3]，目前国内正处于临床研究阶段。注射用TACI-Fc中含有精氨酸、组氨酸、甘露醇等辅料，由于辅料的干扰，采用《中国药典》[4]中常规的蛋白质含量测定方法无法对药物活性成分进行含量测定。为控制TACI-Fc成品质量，笔者拟建立TACI-Fc含量的反相高效液相色谱（RP-HPLC）测定方法，为注射用TACI-Fc的质量评价提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

1200型HPLC仪，包括紫外检测器、四元泵、在线脱气机、柱温箱、自动进样器、Chemstation色谱工作站（美国Agilent公司）。

1.2 试药

TACI-Fc对照品（批号：BZ 2010001，溶液浓度：5.42mg·mL－1，纯度：＞99.5%）、注射用 TACI-Fc（批号：20091201、20100101、20100301，规格：每支80mg）均由烟台荣昌生物工程有限公司提供；乙腈为色谱纯，水为蒸馏水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Vydac C18（250mm×4.6mm，5μm）；流动相A液：含0.1%三氟乙酸的水溶液，流动相B液：含0.1%三氟乙酸的乙腈溶液，梯度洗脱（A液从75%渐变至60%，同时B液从25%渐变至40%），洗脱时间：15min，流速：1.3mL·min－1；柱温：25℃；检测波长：280nm；进样量：25.0μL。在此色谱条件下，取“2.2”项下对照品、供试品溶液、阴性对照溶液进样分析，结果前2种溶液在相同的保留时间处出现吸收峰，而阴性对照溶液在此无吸收峰，说明阴性对照对试验无干扰。色谱见图1。

图1 高效液相色谱图A.对照品；B.供试品；C.阴性对照；1.TACI-FcFig 1 HPLC chromatogramsA.substance control；B.test sample；C.negative control；1.TACI-Fc

2.2 溶液的制备

用微量移液器精密吸取TACI-Fc对照品9.23mL，置于50mL量瓶中，加水定容，得TACI-Fc对照品贮备液（1.0mg·mL－1）。精密吸取贮备液5.0mL，置于10mL量瓶中，水定容，得TACI-Fc对照品溶液（0.5mg·mL－1）。

取注射用TACI-Fc内容物，精密称取适量（约相当于TACI-Fc 25mg），置于50mL量瓶中，水定容，得供试品溶液。

取缺TACI-Fc的阴性样品，精密称取适量，置于50mL量瓶中，水定容，得阴性对照溶液。

2.3 线性关系考察

分别精密吸取TACI-Fc对照品贮备液2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0mL，置于10mL量瓶中，水定容，制备成质量浓度分别为0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8mg·mL－1的系列浓度对照品溶液，进样测定，以峰面积积分值（Y）为纵坐标，质量浓度（X）为横坐标，进行线性回归，得回归方程为Y＝47.016X－8.4679（r＝0.9997）。结果表明，TACI-Fc进样量在5.0～20.0μg范围内与峰面积积分值呈良好线性关系。

2.4 精密度试验

制备低、中、高浓度（0.3、0.5、0.7mg·mL－1）对照品溶液，分别进样，计算含量。同日内重复测定5次，计算日内RSD值，结果分别为0.66%、0.79%、0.72%；连续5d制备并测定，计算日间RSD值，结果分别为1.00%、0.80%、0.86%，表明本法精密度好。

2.5 稳定性试验

取同一供试品溶液25.0μL，分别在0、4、8、12、24h 后进样，测定峰面积。结果，RSD＝1.45%（n＝5），表明供试品溶液在24h内基本稳定。

2.6 重复性试验

取同一批样品，平行制备6份供试品溶液，进样测定。结果，RSD＝0.90%（n＝6），表明方法重复性良好。

2.7 加样回收率试验

精密称取已知含量的同一批样品适量，置于50mL量瓶中，加入不同浓度的对照品溶液，定容。分别取样，测定峰面积，计算加样回收率，结果见表1。

表1 回收率试验结果（n＝9）Tab 1Results of recovery test（n＝9）

2.8 样品含量测定

取3批样品，制备成供试品溶液，分别进样，测定样品含量。结果，3批样品占标示含量百分率分别为97.03%、97.28%、96.55%（n＝3）。

3 论

注射用TACI-Fc为正处于临床研究阶段的一类新药，目前尚无药物含量测定方法的相关报道。TACI-Fc是分子量为80kD的糖蛋白，笔者试验了测定蛋白质含量常用的酶联免疫吸附（ELISA）法和Lowry法[4]。ELISA法虽然检测精密度较高，但测试过程中重复性较差，检测步骤烦琐，检测时间通常在20h以上，因此不适合作为TACI-Fc含量测定的质控方法；而由于注射用TACI-Fc中辅料的干扰，采用Lowry法测定无法得到准确的结果。

笔者以RP-HPLC法测定注射用TACI-Fc的含量，先将TACI-Fc对照品溶液进行连续波段扫描，发现其特征吸收峰在280nm波长处，故采用此波长进行检测。通过调整流动相A液和B液的比例，使TACI-Fc的保留时间合适，所得到的色谱峰与其他杂质峰分离度较好。在流动相中加入0.1%三氟乙酸，改善了主峰拖尾现象，使主峰尖锐对称。另外，笔者还试验了不同流速对分析结果的影响，发现流速在1.0～1.3mL·min－1范围内结果较一致，因此最后选择流速为1.3mL·min－1，可减少分析时间。

综上所述，本文建立的方法操作简便、重复性好、结果准确，适用于测定注射用TACI-Fc的含量。

[1] Nestorov I，Munafo A，Papasouliotis O，et al.Pharmacokinetics and biological activity of atacicept in patients with rheumatoid arthritis[J].J Clin Pharmacol，2008，48（4）：406.

[2] Bracewell C，Isaacs JD，Emery P，et al.Atacicept，a novel B cell-targeting biological therapy for the treatment of rheumatoid arthritis[J].Expert Opin Biol Ther，2009，9（7）：909.

[3] Dall’Era M，Chakravarty E，Wallace D，et al.Reduced B lymphocyte and immunoglobulin levels after atacicept treatment in patients with systemic lupus erythematosus：results of a multicenter，phaseⅠb，double-blind，placebo-controlled，dose-escalating trial[J].Arthritis Rheum，2007，56（12）：4142.

[4] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（三部）[S].2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：附录34.

Content Determination of Recombinant Human B Lymphocyte Stimulator Receptor-IgG Fc Fusion Protein for Injection by RP-HPLC

YAO Xue-jing，LI Zhuang-lin（Yantai RC Biotechnologies，Co.，Ltd.，Shandong Yantai 264006，China）

OBJECTIVE：To establish the method for the content determination of recombinant human B lymphocyte stimulator receptor-IgG Fc fusion protein（TACI-Fc）for injection.METHODS：RP-HPLC method was adopted.The chromatographic column was Vydac C18column with 0.1%trifluoroacetic acid in water as mobile phase A and 0.1%trifluoroacetic acid in acetonitrile as mobile phase B（gradient elution）at the flow rate of 1.3mL·min－1.The detection wavelength was set at 280nm.RESULTS：The linear range of TACI-Fc was 5.0～20.0µg（r＝0.9997）with an average recovery of 99.71%（RSD＝1.14%，n＝9）.CONCLUSION：The method is simple，reproducible and accurate for the content determination of TACI-Fc for injection.

RP-HPLC；Recombinant human B lymphocyte stimulator receptor-IgG Fc；Fusion protein；Content

R927.2；R977.6

A

1001-0408（2012）33-3144-02

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2012.33.29

＊工程师，硕士。研究方向：医药工程。电话：0535-6931915。E-mail：snow8176@sina.com

2011-09-22

2011-12-15）