DNA修复基因多态性与非小细胞肺癌患者含铂方案化疗预后的关系

金艺凤 蒋静涵 黄群联 王 莹 刘东华 (皖南医学院附属弋矶山医院呼吸内科，安徽 芜湖 400)

治疗晚期非小细胞肺癌(NSCLC)的主要手段之一是采用以铂类药物为基础的联合化疗，但不同个体对其敏感性差异较大，预后也不同。其中，DNA修复能力是影响疗效的重要原因〔1〕。核苷酸切除修复途径是铂类药物引起DNA损伤的主要修复途径，切除修复交叉互补基因1(ERCC1)和着色性干皮病基因D(XPD)在核苷酸切除修复中起着重要作用。本文采用DNA测序和限制性酶切片段长度多态性(PCR-RFLP)两种方法检测晚期NSCLC患者ERCC1和XPD基因型，研究不同基因型与NSCLC患者应用含铂方案化疗后生存期之间的关系，探讨ERCC1和XPD的单核苷酸多态性(SNP)是否可以作为预测铂类药物化疗预后的指标，为肿瘤的个体化治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 对象 73例NSCLC患者选自2007年11月至2009年11月皖南医学院附属弋矶山医院住院患者，均经病理学或细胞学确诊。其中男59例，女14例;年龄24～82〔平均(52.7±18.9)〕岁，≤60岁22例，＞60岁51例;鳞状细胞癌42例，腺癌29例，差分化癌2例;按1988年国际肺癌分期标准：Ⅲ期26例，Ⅳ期47例。患者均经CT扫描具有可测量的肿瘤病灶，化疗前检测血常规、肝肾功能均正常，心电图无明显异常，卡氏功能状况评分均＞60分。所有病例均于化疗前抽取外周静脉血2 ml，置于乙二胺四乙酸钠(EDTA)抗凝管，冻存于 －20℃冰柜。

1.2 方法

1.2.1 化疗方案及疗效评价 所有患者化疗前签署化疗知情同意书，接受以顺铂(cisplatin，DDP)为基础的化疗。具体方案：DDP/紫杉醇(15 例)、DDP/长春瑞滨(11 例)、DDP/吉西他滨(34例)、DDP/多西紫杉醇(13例)。具体用法：DDP 30 mg/m2，第2 ～4 天;长春瑞滨(Navelbine)25 mg/m2，第 1、8天;吉西他滨(Gemcitabine)1 000 mg/m2，第1、8 天;紫杉醇(paclitaxel)175 mg/m2，第1天(维持3 h);多西紫杉醇(docetaxel)60 mg/m2，第1天(维持1 h);均经静脉滴注。上述治疗方案每3～4 w重复，均在2～3个周期后评价疗效。疗效评价参照WHO实体瘤(1981年)标准分为完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、稳定(SD)和进展(PD)。以 CR +PR +SD为临床获益。

1.2.2 临床评价 总生存期(OS)为最终评价指标。OS为从确诊日起至患者死亡(死于原发肿瘤或并发症)的日期;在数据截止尚生存的患者，以末次随访时间作为截尾数据进行分析。

1.2.3 DNA抽提扩增 采用标准酚-氯仿提取法抽提外周静脉血DNA〔2〕。4℃保存备用。引物参照文献设计(表1)，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR总反应体积50 μl：模板 DNA 2 μl，Taq 酶 2.5 U，10 × buffer 5 μl，MgCl21.5 mmol/L，dNTPs 0.2 mmol/L。上 游 及 下 游 引 物 各10 pmol/L，加ddH2O至总体积50 μl。反应在PTC-150型热循环仪(美国MJ公司)上进行，98℃ 5 min蛋白变性后，加入Taq酶(TIANGEN公司产品)，进入热循环。ERCC1反应条件为：94℃变性30 s;56℃退火30 s;72℃ 延伸1 min，共33个循环，最后72℃延伸4 min。XPD反应条件为：94℃变性30 s;59℃退火30 s;72℃延伸1 min，共33个循环，最后72℃延伸4 min。取10 μl PCR扩增产物加样，1.5%琼脂糖凝胶电泳60 min(电压100 V)，溴乙啶(EB)染色，紫外灯下检测扩增产物，数码相机摄片保存，PCR产物4℃保存备用。

表1 PCR扩增引物、退火温度、PCR产物大小

1.2.4 基因分型

1.2.4.1 DNA测序 PCR产物经DNA凝胶纯化试剂盒(Axygen公司产品)纯化回收，30 μl纯化后的 PCR产物连同其上游引物由南京金斯瑞生物科技有限公司采用双脱氧法在ABI-3730XL测序仪上进行单向测序。

1.2.4.2 PCR-RFLP法进行基因型分析 取10 μl ERCC1 C118T的PCR纯化产物与2 μl BsrDⅠ(New England BioLabs公司)65℃水浴消化4 h，8 μl XPD Lys751Gln的PCR纯化产物与2 μl限制性核酸内切酶Pst I(New England BioLabs公司)于37℃水浴消化3 h，用2.0%琼脂糖凝胶电泳分离酶切片段，80 V电泳40 min，EB染色确定各基因型。同时，为保证基因分型的准确性，随机挑选10例(13.7%)进行重复实验。

1.3 统计学方法 应用SPSS16.0统计软件进行分析，采用Kaplan-Meier法进行单因素生存分析、χ2检验和Log-rank检验。

2 结果

2.1 ERCC1、XPD基因型与临床特征的关系 患者性别、年龄、不同的组织学类型和临床分期间ERCC1、XPD基因型差异无统计学意义。见表2。

2.2 测序结果与PCR-RFLP方法结果 ERCC1 C118T、XPD Lys751Gln DNA测序结果与PCR-RFLP法结果图一致，且各等位基因符合Hardy-Weinberg平衡定律。见图1～图7。

图1显示在ERCC1 C118T多态性位点碱基C没有发生突变，只有 C一个波峰;PCR-RFLP法显示1个片段(199 bp)，为C/C基因型。图2显示ERCC1 C118T多态性位点已突变为碱基T，只有 T一个波峰;PCR-RFLP法显示2个片段(120和79 bp)，为T/T基因型。图3显示在ERCC1 C118T多态性位点有碱基 C和 T两个波峰出现;PCR-RFLP法显示3个片段(199、120和 79 bp)为 C/T基因型。图 4显示在 XPD Lys751Gln多态性位点碱基A没有突变，只有A一个波峰;PCR-RFLP法显示2个片段(189、131 bp)，为A/A(Lys/Lys)基因型。图5显示在XPD Lys751Gln1多态性位点一处碱基A没有突变，只有A一个波峰;另一处碱基A和 C两个波峰出现;PCR-RFLP法显示4个片段(189、131、126和 63 bp)，为 A/C(Lys/Gln)基因型。本研究中未发现C/C(Gln/Gln)基因型。

表2 患者一般情况与ERCC1、XPD基因型的关系〔n(%)〕

2.3 ERCC1、XPD基因型分布 73例晚期 NSCLC ERCC1 C118T存在三种等位基因型，其基因频率分别为：C/C型基因频率53.4%(39/73)，C/T型基因频率 38.4%(28/73)，T/T型基因频率8.2%(6/73)。本研究只检测到XPD Lys751Gln两种等位基因型，其基因频率分别为：A/A型83.6%(61/73)，A/C型16.4%(12/73)，未检测到纯合基因突变型C/C型。

2.4 ERCC1和XPD基因型与NSCLC患者临床预后的关系随访截止时间为2011年9月，全部患者中位生存期为18个月。ERCC1 C118T CC型中位生存期〔(19.803±4.604)个月〕与CT型中位生存期〔(15.993±4.283)个月〕、TT型中位生存期〔(16.233±1.369)个月〕之间的差异有统计学意义(χ2=12.855，P=0.000;(χ2=8.602，P=0.003);而 CT 型中位生存期与TT型中位生存期差异无统计学意义(χ2=0.701，P=0.402)。XPD A/A型中位生存期、A/C型中位生存期〔(18.044±4.831)、(18.075±4.667)个月〕差异无统计学意义(χ2=0.034，P=0.854)。见图 8，图 9。

图1 ERCC1 C118T C/C基因型测序

图2 ERCC1 C118T T/T基因型测序

图3 ERCC1 C118T C/T基因型测序

图4 XPD密码子751 A/A基因型测序

图5 XPD密码子Lys751Gln A/C基因型测序

图6 ERCC1 C118T经限制性内切酶BsrD I作用后的琼脂糖凝胶电泳图

图7 XPD Lys751Gln经限限制性内切酶Pst I作用后的琼脂糖凝胶电泳图

图8 ERCC1不同基因型的NSCLC患者总生存期生存曲线

图9 XPD不同基因型的NSCLC患者总生存期生存曲线

3 讨论

循证医学研究证实，NSCLC的化疗以铂类为基础，含铂方案优于不含铂方案〔3〕。已有研究表明各种以铂类为基础的联合方案在有效率和生存期上均无显著差异〔4〕，但患者对它们的敏感性差异显著，预后也不同。药理遗传学和基因组学研究表明，肿瘤基因的SNP及其分子表达水平与化疗疗效和毒性反应密切相关。

ERCC1基因的表达产物与DNA修复酶缺乏互补基因F(XPF)形成紧密的ERCC1-XPF异二聚体，是特异性的核酸内切酶，具有识别和切除 DNA 5'端的双重作用〔5〕。ERCC1 C118T可发生核苷酸 C→T改变，虽然两者编码的都是天门冬氨酸(asparagine，Asn)，但C→T转换可能与密码子选择减半、ERCC1 mRNA产物及随后的蛋白翻译降低有关，降低了DNA修复能力(DNA repair capacity，DRC)〔6〕。

本研究显示，NSCLC患者外周血中ERCC1 C118T C/C型的总生存时间较C/T型、T/T型延长，提示ERCC1 C118T C/C型的NSCLC患者接受以铂类为基础的化疗可能生存获益。这个结果与Su等〔7〕研究结果一致。钱晓萍等〔8〕研究肿瘤石蜡组织中ERCC1 codon118 SNP与接受铂类药物化疗NSCLC患者临床预后之间的关系，结果显示C/C基因型患者的中位生存时间为25.0个月，而C/T及T/T基因型患者的中位生存时间仅为10.5个月，两者有统计学差异，认为ERCC1 codon118基因SNP可作为判断NSCLC患者铂类药物化疗的预后指标。而Zhou等〔9〕研究结果显示携带ERCC1 C118T C/T型、T/T型患者的总生存期较C/C型明显延长(17.5个月、13.5个月)。究其原因，可能与病理分期以Ⅳ期为主有关，有必要加大样本量进一步研究证实ERCC1基因型与临床预后的关系。

XPD基因产物具有ATP依赖的5'→3'DNA解旋酶活性。XPD蛋白是转录因子复合物Ⅱ型转录因子H(transcription factorⅡH，TFⅡH)的核心组分，并且参与核苷酸切除修复和基因转录过程〔10〕。XPD在DNA修复过程中通过NER途径去除多种因素导致的DNA损伤(如：铂-DNA加合物)来发挥作用。该基因第751密码子A→C改变导致Lys→Gln氨基酸替代。Lys751Gln(A→C)为有义突变导致氨基酸改变，从而影响DNA修复途径。本研究显示XPD Lys751Gln A/A型的中位总生存时间与A/C型比较差异无统计学意义，与陈君臣等〔11〕的研究结果一致。

综上所述，本研究证实ERCC1 C118T多态性与NSCLC患者铂类药物化疗后的生存期有关，在一定程度上可作为铂类药物化疗后生存期的预测指标。

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2 黄培堂译.分子克隆实验指南〔M〕.第3版.北京：科学出版社，2002：467-70.

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4 Smit EF，van Meerbeeck JP，Lianes P，et al.Three-arm randomized study of two cisplatin-based regimens and paclitaxel plus gemcitabine in advanced non-small-cell lung cancer：a phase Ⅲ trial of the European Organization for Research and Treatment of Cancer Lung Cancer Group-EORTC 08975〔J〕.J Clin Oncol，2003;21(21)：3909-17.

5 Takenaka T，Yoshino I，Kouso H，et al.Combined evaluation of Rad51 and ERCC1 expressions for sensitivity to platinum agents in non-small cell lung cancer〔J〕.Int J Cancer，2007;121(4)：895-900.

6 Viguier J，Boige V，Miquel C，et al.ERCC1 codon 118 polymorphism is a predictive factor for the tumor response to oxaliplatin，5-fluorouracil combination chemotherapy in patients with advanced colorectal cancer〔J〕.Clin Cancer Res，2005;11(17)：6212-7.

7 Su D，Ma S，Liu P，et al.Genetic polymorphisms and treatment response in advanced non-small cell lung cancer〔J〕.Lung Cancer，2007;56(2)：281-8.

8 钱晓萍，刘宝瑞，严文跃，等.ERCC1codon118单核苷酸多态性与小细胞肺癌铂类化疗的临床预后研究〔J〕.现代肿瘤医学，2011;19(10)：1997-2001.

9 Zhou C，Ren S，Zhou S，et al.Predictive effects of ERCC1 and XRCC3 SNP on efficacy of platinum-based chemotherapy in advanced NSCLC patients〔J〕.Jpn J Clin Oncol，2010;40(10)：954-60.

10 Giachino DF，Ghio P，Regazzoni S，et al.Prospective assessment of XPD Lys751Gln and XRCC1 Arg399Gln single nucleotide polymorphisms in lung cancer〔J〕.Clin Cancer Res，2007;13(10)：2876-81.

11 陈君臣，刘志良，成 健，等.XPD基因单核苷酸多态性与晚期非小细胞肺癌对铂类药物敏感性的关系〔J〕.中国老年学杂志，2011;31(7)：1114-7.