基因组学技术辟克癌新路

文/高妍 李会会

黄健博士

黄健，博士，研究员。多年从事肿瘤基因组学和分子遗传学研究，曾任职于国家人类基因组南方研究中心、深圳华大基因研究院等单位，2011年6月起担任生物芯片上海国家工程中心肿瘤基因组学转化应用研究室主任、上海市疾病与健康基因组学省部共建重点实验室课题组长。

先后承担多项国家“863”计划项目、国家“973”项目、国家自然基金项目、国家博士后资助计划一等资助项目、上海市科委自然科学基金重点项目、上海市学术技术带头人项目、深圳市生物产业高技术产业项目等。相关研究先后发表在《Nature Genetics》《JCI》《PNAS》《Carcinogenesis》《Cancer Research》等十几家国际杂志上。获得4项上海市科研成果奖、9项国家授权发明专利，参与编写专著两部。

“这是世界上第一次利用新型大规模基因组分析技术研究肝癌转移问题，所获结果将为肝癌诊断、预后、治疗以及开发新型治疗药物奠定基础。”

针对我国科学家在肝癌转移关键突变基因研究中取得的最新成果，国际顶尖学术杂志《自然•遗传学》审稿人及有关专家给出了以上评价。

成果研究报告于2012年8月26日在国际著名杂志《自然•遗传学》网站上在线发布。报告指出：研究团队利用DNA测序技术，对比分析了乙肝病毒感染相关的肝癌原发灶和侵犯肝脏门静脉的转移灶的全部基因外显子序列，发现肿瘤细胞中共存在347个突变基因，其中大多数是首次在肝癌样本中发现，且同时出现在了原发灶和转移灶上。最终，他们验证评估出了ARID1A、VCAM1和CDK14三种基因的突变可能与肝癌的发生和转移密切相关。

这一成果的发布在行业内引起强烈反响。几经周折，本刊联系到了研究团队的领导者之一、生物芯片上海国家工程研究中心肿瘤基因组学转化应用研究室主任黄健博士，在与他的交流过程中，有幸了解到成果背后的点点滴滴。

向“癌中之王”宣战

肝细胞癌是原发性肝癌的主要形式，也是世界范围内发病率最高的恶性肿瘤之一。据统计，全世界每年新发现肝癌100万左右，占恶性肿瘤的5%左右，其中有40%以上发生在中国。

肝癌在我国素有“癌中之王”称号。普查资料表明，我国肝癌的发病率为14.58/10万～46/10万。全国死亡原因回顾调查显示，肝癌在男性中平均死亡率为14.52/10万，仅次于胃癌和食管癌；女性为5.61/10万，仅次于胃癌、宫颈癌和食管癌。

近几十年来，肝癌研究取得了可喜进展，但无论东方还是西方，整个人群的肝癌5年生存率仍只有5%左右，而我国的平均肝癌发病率和死亡率均有明显上升趋势。到现在为止，人们对肝癌的发病机制还不甚清楚，特别是对肝癌转移的分子机制了解甚少。

研讨会后，黄健（左四）与桂林医学院的合作者合影

因此，科研人员针对肝癌的攻坚战役从未停歇，21世纪的肝癌防治研究更加刻不容缓。这也正是黄健投身肝癌研究的原因之一。“利用先进的科学技术解决我国自己的事情，为最终消灭严重危害我国人民身心健康的‘癌中之王’提供理论依据和技术支撑。”黄健说。

2001年，黄健开始在国家人类基因组南方研究中心进行客座研究，之后留在南方研究中心担任课题组长，直到2009年自上海交通大学博士后出站，才到深圳华大基因研究院担任健康事业研发部主任。这期间，他一直围绕肿瘤基因组学和分子遗传学这一方向开展针对肝癌的研究工作，也就是利用基因芯片和高通量测序技术及生物信息学手段，系统分析肿瘤基因组、转录组和甲基化组的变异，进而探讨各种变异与临床特征的关联性，结合细胞学和动物学技术识别鉴定与肿瘤相关的重要功能基因，深入研究其在肿瘤发生、发展中的分子机制，为肿瘤的临床诊断提供新的指标，或为最终治愈肿瘤提供潜在的药物靶点。

黄健介绍，临床实践发现，肝癌的转移发生率较高，甚至早期小肝癌亦可能已有肝外转移。通常多先有肝内播散，然后出现肝外转移。肝内直接扩散是指癌细胞通过肝窦或窦旁间隙，直接扩散到肝内其他部位，转移癌灶呈卫星状分布，也可远离原发癌，此种方式转移最早，也最常见。此外，可侵犯门静脉并形成门静脉瘤栓，如瘤栓脱落在肝内，则引起多发性转移灶；门静脉主干瘤体阻塞，可引起门静脉高压和顽固性腹水，最终引起死亡。

“我们知道，转移发生率与肝癌的生物学特性密切相关，特别是肝癌细胞内转移促进基因和转移抑制基因的平衡失调在肝癌转移中起到重要作用。因此，利用先进的分析技术，系统研究正常组织、癌组织和转移组织间基因谱系的差别，就有可能发现与肝癌转移密切相关的基因和基因变异类型，为临床诊断和治疗提供新的思路。”基于这一认识，在科技部“973”计划和卫生部中长期科技发展规划“艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治”科技重大专项的支持下，黄健和他的伙伴们开始了这项关于肝癌转移关键基因的探索性研究。

肝癌转移关键基因的发现

关于肝癌转移关键基因的研究始于2010年。两年里，黄健和研究团队分工协作、共同努力，攻克了高通量测序技术的理解和应用、海量数据的分析、更大规模样本量的实验验证、肝癌高频突变基因功能的细胞生物学研究等关键环节，最终取得现在的成果。

黄健说，只有身处其中，才能真正懂得这其中饱含的辛苦与酸楚，也只有身处其中，才能体会到这样一项浩大工程从启动到实施再到完成整个过程所蕴含的快乐与满足。

他们收集了10例HBV阳性肝癌患者手术后的癌旁组织、原发癌组织和肝内转移的门静脉癌栓，利用基因组学领域内最先进的DNA序列分析技术，对这些样本进行全外显子组测序分析，并结合生物信息学技术仔细识别每一例患者的三种样本间的DNA序列的微小差异，最终发现：肿瘤细胞存在347个突变基因，平均每个肿瘤样本有30～40个基因突变，其中大多数基因突变是第一次在肝癌样本中发现，并且在原发灶和转移灶中同时出现。这说明肝癌的发病和转移与基因突变密切相关，并且转移相关基因在原发癌中就已经发生了突变。

随后他们在更大量的肝癌样本中对基因突变进行了验证，并且用RNA干扰技术评估了91个已被证实存在突变的基因对肝癌细胞生长的影响。评估结果显示：ARID1A、VCAM1和CDK14三种基因的突变可能与肝癌发生、转移密切相关。

“ARID1A基因突变在多种人类肿瘤中均被发现有突变发生，比如卵巢癌、子宫内膜癌、胃癌、肾癌、膀胱癌等。在我们的这项研究中，ARID1A基因在13%肝癌组织中均发生突变。有同行预测，该基因有可能是继P53基因之后，又一个肿瘤基础研究和开发应用的明星分子。VCAM1基因除了突变外，还在多数肝癌样本中表达下降。而与细胞增殖相关的CDK14基因突变则会增强该基因功能，导致细胞生长加快，促进转移。”黄健解释道。

黄健参加学术交流会时发言

这些肝癌转移关键基因的锁定，为我们提供了可能与中晚期肝癌相关的体细胞突变的图谱，并为人类发现有关驱动肝癌发生及转移分子途径提供了重要的线索，更为未来开发临床可用的肝癌诊断试剂和新型药物提供了新的靶点。

回首整个研究过程，黄健说，他们遇到的最大困难就是海量数据的分析，这也是高通量测序技术面临的最大问题。他介绍，目前国际上常用的高通量测序技术有三种：Illumina公司的Solexa系统、ABI公司的 SOLiD系统和Roche公司的454系统。前两种所获得的序列较短，但序列的数量比较多，而454系统虽然序列比较长，但一次实验所获得的序列总数较少。

项目启动之初，他们并不清楚每种平台的不足，更不了解这些不足会对研究工作的推进带来哪些影响。“所以我们选择了Solexa和SOLiD两种系统平台同时开展工作。先用Solexa系统进行序列分析，再用SOLiD系统对相同的样本进行二次分析，最后选择两种技术共同检测到的基因变异位点作为后续深入研究的最终数据集。这样做能够尽可能地弥补技术本身的不足，可以最大限度地确保结果的准确性。”347个突变基因就是在这一繁琐的过程中筛选出来的。

而早在2006年，黄健团队就曾利用Solexa系统的前身技术，完成了我国首例肝脏转录组的测序和分析工作，当时序列的长度是18bp。2010年，团队又完成了中国首个“百种单基因遗传病”的高通量测序和数据分析工作。这项研究建立的技术可以一次同时检测100种单基因遗传病致病基因的变异谱，不仅能够发现已知的突变类型，而且可以发现新的基因突变，为产前诊断和遗传咨询奠定了很好的基础。这些经验都为本次的研究工作顺利完成奠定了良好的基础。

团结奋斗共同成长

任何成果都不是一蹴而就的，它来源于研究者长期的积累与沉淀。而该项目短短两年时间就取得如此显著成果，更得益于国内多家优秀科研单位和医院的共同发力。

这一项目的实施得到了科技部和卫生部的大力支持，由国家人类基因组南方研究中心、生物芯片上海国家工程研究中心、上海伯豪生物技术有限公司参与领导，并联合了深圳市第三人民医院、复旦大学附属中山医院和无锡市人民医院等国内多家知名医院共同完成。

“我们一直认为，医学研究工作是利用先进的科学技术解决临床中急需解决的问题，这需要多方的合作。”黄健说，正是各方强烈的合作意愿和共同的研究目标促成了本次的联合研究机制。

也正是这一合作机制的建立，最大化整合了国内基因组学研究领域的各项优质资源，包括研究人员、研究平台、研究样本等，确保甚至加速了各项科研工作的顺利开展。

如果说联合研究机制的推动是成果取得的切实保障，那么黄健等项目领导者在过去研究过程中所积累的丰富经验，就是成果取得的雄厚基石。

2009年12月，由黄健和导师韩泽广教授领导的功能基因课题组在国际著名杂志The Journal of Clinical Investgation（《临床研究杂志》）上发布抑癌基因研究方面的新进展—发现了一个可以抑制肝癌转移的关键基因SCARA5。

黄健介绍，SCARA5基因位于第8号染色体短臂上，之前一直没有引起注意。课题组利用大规模功能基因组方法筛选，历经4年，才在几万个基因中发现了这个对肝癌转移有举足轻重作用的基因SCARA5。

研究发现，正常肝脏中，SCARA5所表达的蛋白质的量很高，但在约80%的肝癌样本中，几乎找不到它所表达蛋白的踪影。他们通过小鼠动物实验证明了自己研究思路的正确性。

黄健研究团队

随后他们在更深入的研究中发现，SCARA5基因的使命实际上是抑制癌基因FAK的活性，不让它活化。因为活化的FAK，会驱使癌细胞疯狂扩散，更能够使正常细胞发生过度增殖。

评审专家认为，这不仅是发现了一个与癌症相关的重要基因，为肝癌提供了潜在新型诊断和治疗方法，还采用了新的研究方法，拓展了研究思路。

另一项研究成果发表于2006年11月，当时黄健已经担任了国家人类基因组南方研究中心的课题组长。在韩泽广教授的指导下，发现了可能是非常有效的肝癌治疗新靶点—印迹基因DLK1。

研究中，他们对82例肝癌样本进行了检测，发现DLK1基因在73.2%的肝癌样本中表达明显上升，而在正常健康的肝脏组织中DLK1基因并不表达。

此外，利用免疫组织化学染色技术，检测另外88例原发性肝癌组织样本，他们还发现DLK1基因与目前临床常用的肝癌早期诊断指标甲胎蛋白在病理诊断上能形成互补，联合检测DLK1基因和甲胎蛋白可以将肝癌的诊断率提高25%以上，这显示了DLK1基因可能发展为新的肝癌诊断指标的潜质。

他们还发现，降低DLK1基因表达水平能明显抑制肝癌细胞的增殖，并通过动物实验进一步证明了这一重要结论。这些都说明DLK1基因可能是非常有效的肝癌治疗新靶点，为开发药物治疗肝癌提供了新的思路。

基因服务健康值得期待

黄健介绍，在过去的一年里，大约每个月都有两到三个家族全基因组和全外显子组测序工作被用于疾病的基因变异检测。

马里兰贝塞斯达国家卫生研究所的“不能确诊疾病计划”，已经接待了超过5000次的咨询、查阅了3000份医疗文件，并对15%的病例进行了基因组学技术诊断。

遗传学家和儿科医生Thomas Markello介绍说，他的研究小组已经确证多个疾病的遗传病因，还有大量的新志愿者需要进行验证。

英国医学研究临床科学中心的分子遗传学家Tim Aitman说，全基因组测序将直接使患者受益。尽管现在听起来像奇闻，“但它是不可忽视的，并有可能在未来的5～10年内更加普及。”

在世界的各个角落，基因组学的知识和技术都在迅速的发展和进步，它所表现出的巨大潜能，吸引着世界各地科学家们为相关技术大范围走进临床、服务大众、改善民生而不断努力。

而我们的科学家，也不曾懈怠。黄健他们正对肝细胞癌进行更深入的研究，比如在国家“863”计划支持下，针对肝细胞癌的全基因组和全转录组序列数据进行整合分析，试图从一个全新的视角解读肝癌发生和发展规律；另外，在国家自然基金和上海市科委重点项目资助下，系统研究肝癌的甲基化和羟甲基化谱，并探讨两种谱系的异常对基因表达的影响。“这些都是基于高通量数据的分析，希望最终的研究成果能够为人们全面认识肝癌，并最终攻克肝癌提供帮助。”在深入开展医学基础研究之外，黄健团队还在积极探索基因组学技术在临床的转化应用，比如基于外周血中的核酸（DNA和RNA），利用高通量测序，开发单基因病和染色体病的产前诊断技术，以及肿瘤的早期诊断和转移复发监测技术，希望能在公共卫生领域解决一些实际问题。此前，惠及广州地区数万名育龄妇女的“预防宫颈癌HPV筛查”活动，就采用了他们研发出的一种快速、准确、低价的宫颈癌检测技术。

克癌路漫漫，信念伴前行，风雨过后终将迎来绚丽的彩虹。在科学家们的努力推动下，基因组学正快速发展，用基因服务健康，这一美好未来值得期待。

黄健（左二）在广东鹤山址山镇的“适龄妇女宫颈癌免费筛查项目”培训现场