肝细胞生长因子基因修饰骨髓间充质干细胞

具星爱 刘滋康 郭子宽 李占全

(1.辽宁省人民医院 沈阳 110016; 2.安徽医科大学第三附属医院院士工作站 合肥 230000;3. 军事医学科学院 北京 100850)

人骨髓间充质干细胞(hMSC)是一种成体干细胞,可诱导分化软骨、骨骼、脂肪等多种组织,并且分泌多种细胞因子及生长因子,如内皮细胞生长因子、表皮生长因子、白介素-4、白介素-10等,具有免疫调节功能。鉴于此,hMSC已被用于多种疾病的治疗。肝细胞生长因子(HGF)是一种具有多种功能的细胞因子,可以促进血管新生、肝脏修复、抑制细胞凋亡,还可以趋化外周血干细胞迁徙至组织修复部位。本研究针对hMSC用腺病毒介导的基因修饰HGF,并对其进行鉴定。

1 方法

1.1 骨髓hMSC的原代分离培养以及Ad-HGF转染

取肝素抗凝的正常人骨髓5mL,用密度梯度离心法收获单个核细胞层,按照2.0×105cells/cm2的密度接种细胞培养皿,以含10%FBS的α-MEM进行培养。当细胞生长汇合率为80%～90%时,消化并传代。培养hMSC至第三代,生长汇合率达到70%～80%,在无血清培养体系中按照感染复数MOI=150pfu/细胞加入重组Ad-HGF的腺病毒颗粒。首先吸去培养上清,PBS洗涤培养瓶底面2遍后加入含Ad-HGF腺病毒颗粒的无血清α-MEM,体积为原先培养体积的一半。37℃,5%CO2和饱和湿度条件下孵育2h,加入相同体积的MSC完全培养基,使FBS的终浓度达到10%。继续培养48h,收获的细胞即为hMSC/Ad-HGF。按上述同样方法,携带GFP基因的腺病毒载体(Ad-GFP)转染hMSC作为对照。

1.2 hMSC/Ad-HGF的鉴定

图1 hMSC/Ad-HGF表面标志物的鉴定

1.2.1 转染前后细胞形态的鉴定 我们采用瑞士吉姆萨染色方法,对hMSC、hMSC/Ad-HGF进行光学显微镜下观察细胞的形态,转染Ad-GFP的hMSC形态则在荧光显微镜下观察。

1.2.2 转染前后细胞表型的鉴定 第三代对数生长期的hMSC/Ad-HGF,用0.1%胰蛋白酶消化后计数,每2.0×105个细胞分别与FITC或PE标记的小鼠抗人CD31-PE,CD45-PE,CD34-PE,CD29-PE,CD14-PE,CD44-PE单克隆抗体避光孵育30min,流式细胞仪检测,WinMDI 2.9软件进行分析。

1.2.3 培养上清HGF浓度的鉴定 利用ELISA方法,以hMSC和hMSC/Ad-GFP作为对照,对hMSC/Ad-HGF培养上清的HGF浓度进行测定。将3组细胞均换成无血清α-MEM后继续培养24h,收集细胞培养上清,抗原包被,HGF标准品浓度梯度(ng/mL):200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、0,同时设空白调零孔,每稀释度作5复孔,100µL/孔,4℃过夜。24h后,弃包被液,用1%BSA溶液封闭过夜,加入HGF抗体,100µL/孔,用封口膜封住反应孔,37℃孵育60min。弃一抗,用加入二抗,每空100uL,37°孵育45min。用含0.05%Tween-20的PBS洗去未结合的抗体,3×5min;用OPDH2O2系统显色,490nm波长测定光密度值。

1.3 统计学分析

数据以平均数±标准差表示,以t检验进行统计学处理,P<0.05为显著性差异。

2 结果

2.1 转染前后hMSC的形态学鉴定

光镜下观察形态结果,hMSC转染前后均为成纤维样细胞形态,但是转染后的细胞增殖较快,细胞数量明显增加,说明转染肝细胞生长因子不会导致骨髓间充质干细胞形态的改变,同时也可说明转染肝细胞生长因子不会阻碍骨髓间充质干细胞的增殖。通过荧光显微镜观察,腺病毒感染后24h可见绿色荧光表达,说明腺病毒能够有效感染原代MSC细胞,可以作为MSC基因治疗的载体。

2.2 转染前后细胞表型的鉴定

经过基因修饰的hMSC是否表达原来的表型？本实验应用流式细胞仪检测了细胞表型。如图1所示,hMSC/Ad-HGF大小和颗粒度相对均一,表达间充质干细胞特异性表面抗原分子CD44和CD29,而不表达造血细胞及内皮细胞的标志物CD34,CD45,CD14和CD31,与hMSC的细胞表型完全一致。这说明转染Ad-HGF后hMSC细胞表面标志物并没有改变。

2.3 hMSC/Ad-HGF培养上清HGF浓度的鉴定

hMSC基因修饰Ad-HGF48h后,ELISA方法检测HGF表达水平。结果hMSC/Ad-HGF的培养上清中HGF浓度达到(80.6±4.6)ng/mL,接近于对照组3.8倍。hMSC/Ad-HGF培养上清中HGF浓度显著高于hMSC和hMSC/Ad-GFP组(P<0.001),而后两者之间的HGF培养上清HGF浓度无显著性差异。

3 讨论

上世纪60年代Friedenstein A J等发现,骨髓间充质干细胞在体外贴壁培养形成集落,并在不同条件下可诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、基质细胞、成纤维细胞和肌腱细胞、心肌样细胞等,具备多向分化潜能。MSCs具有广泛的应用价值。

大鼠肝脏再生过程中,血浆内存在一种与损伤肝脏的修复密切相关的蛋白质组分,称为肝细胞生长因子,HGF是目前进入临床试验阶段促血管形成细胞因子之一,可以促进血管新生、肝脏修复、抑制细胞凋亡、还可以趋化外周血干细胞迁徙至组织修复部位。

本实验原代培养人骨髓间充质干细胞后转染Ad-HGF,首先从形态学证实Ad-HGF转染不会导致骨髓间充质干细胞发生形态学的变化,不会阻碍hMSC的体外增殖。我们选取公认的MSC特异性细胞表面标志物进行流式细胞术测定[6],hMSC/Ad-HGF大小和颗粒度相对均一,细胞较均一地表达CD44和CD29,而不表达CD31,CD34,CD45和CD14,说明基因修饰前后的hMSC细胞表型没有改变变。利用ELISA法测定培养上清HGF浓度,结果转染Ad-HGF后,hMSC培养上清中HGF浓度显著增加,达到80ng/mL,接近转染前的3.8倍,而转入hMSC/Ad-GFP的培养上清中HGF浓度未有显著性变化。

[1]Friedenstein AJ,Gorskaja JF,Kulagina NN.Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs[J].Experimental Hematology,1976,4(5):267～274.

[2]Valtieri M,Sorrentino A.The mesenchymal stromal cell contribution to homeostasis[J].J Cell Physiol,2008,217:296～300.