桃金娘色素稳定性及初步分离研究

张少敏，崔 春，赵谋明，陈文芬

（华南理工大学轻工与食品学院，广东广州510640）

桃金娘色素稳定性及初步分离研究

张少敏，崔 春*，赵谋明，陈文芬

（华南理工大学轻工与食品学院，广东广州510640）

研究了桃金娘色素的稳定性和理化性质，并对其进行了初步分离纯化，为桃金娘色素的推广应用提供理论基础。研究结果表明，桃金娘色素易溶于酸性水溶液、酸性醇溶剂，不溶或难溶于非极性溶剂；在溶液pH小于4.0时桃金娘色素对光、热有较好的稳定性，其最大吸收波长为516nm；耐强氧化剂和还原剂较差；Zn2+、K+、Al3+、Na+、Ca2+离子对桃金娘色素有不同程度的保护和增色作用，但Mg2+、Fe3+离子降低色素的稳定性。经过葡聚糖凝胶LH-20柱层析和高效液相色谱分离纯化，表明桃金娘色素主要由4种色素组成。

桃金娘，色素，稳定性，分离

近年来，合成食用色素对人体的危害已日益引起人们的高度重视，而天然色素主要是从生物体中提取的，由于其安全性高、且具有一定功能特性，在食品、化妆和医药行业中的应用日益广泛[1]，因此世界各国均在大力研究和开发食用天然色素[2]。桃金娘（Rhodomyrtus tomentosa）为桃金娘科药用植物，又称稔子、山稔，主要分布于我国南方各省，成熟的果实中富含多种有益的化学成分，并具有药效功能[3-4]，目前对于桃金娘的开发利用主要集中在医药、植物资源、生态学[5-6]等领域，食品工业领域中对桃金娘果实在饮料[7-8]方面的研究较多，对其果实中的桃金娘色素（Rhodomyrtus tomentosa pigment，简称RTP）研究较少。本文探讨了桃金娘色素的理化性质及其稳定性，并对该色素进行了初步分离，旨在为桃金娘色素在食品工业中的应用提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

全熟的桃金娘果实 采于广东汕尾，装于封口袋，-20℃冻藏保存待用；无水乙醇、乙酸乙酯、甲醇、石油醚、浓盐酸、蔗糖、柠檬酸、抗坏血酸 均为分析纯。

X-5型大孔树脂 天津海光公司；Sephadex LH20瑞典Pharmacia公司；GL-21M高速冷冻离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司；pHS-25数显pH计 上海精密仪器有限公司；UV-1800紫外-可见分光光度计 日本岛津公司；3001多功能酶标仪 美国Thermo公司；UV-2100紫外可见分光光度计 尤尼科（上海）仪器有限责任公司；Waters高效液相色谱仪 美国Waters公司。

1.2 实验方法

1.2.1 桃金娘色素的粗提取 将新鲜桃金娘果实洗净切碎后，取100g，加酸化80%乙醇500mL。浸提温度50℃，浸提时间3h，浸提两次。将浸提后的试样挤压过滤得到粗滤液，8000r/min离心20min，抽滤得到红色澄清色素提取液，最后再将色素溶液减压蒸馏，得到深紫红色色素膏体。

1.2.2 桃金娘色素粗提物的纯化 采用石油醚、氯仿、乙酸乙酯对浓缩液分别萃取三次，再用X-5大孔树脂层析柱（φ1.25×30cm，使柱高约9cm，柱床体积约11mL）对澄清提取液上柱进行纯化，0.5%HCl-80%乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，得到粗纯化的色素[9]。

1.2.3 桃金娘色素理化性质的研究方法

1.2.3.1 桃金娘色素的溶解性及可见光吸收特性[10]室温25℃下，取1.0g桃金娘色素浸膏以1%的浓度分别用水、无水乙醇、含水乙醇、乙醚、无水甲醇、含水甲醇、丙酮、石油醚、乙酸乙酯、氯仿、5%盐酸溶液等进行溶解性实验[11]。取等体积色素浓缩液分别用pH1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0系列缓冲液定容，稳定1h，400～600nm光谱扫描，获得桃金娘色素液在各pH条件下的可见光谱吸收特性。

1.2.3.2 pH及光照对桃金娘红色素稳定性的影响 色素浓缩液分别用pH1.0～9.0的缓冲液定容（1mL→10mL），避光静置1h，在最大吸收波长处测定吸光度作为初始值A0，用pH1.0、3.0、5.0的缓冲液配制的色素稀释液分别置于室内自然光照射及避光条件下，每隔24h取样测吸光度Ai，以Ai/A0计算色素残存率，色素最大吸收波长设定为：pH1.0～2.0（514nm），pH3.0～6.0（516nm）。

1.2.3.3 不同温度对桃金娘色素稳定性的研究 取三份色素浓缩液，分别调节色素液pH为1.0、3.0、5.0，将色素液分装在棕色试剂瓶中，于不同温度恒温水浴锅加热处理3h，测定色素液吸光度值，以A处理后/A处理前计算色素残存率。

1.2.3.4 有机酸、氧化剂、金属离子、糖对桃金娘色素稳定性的影响 配制不同浓度柠檬酸、苹果酸、酒石酸、没食子酸、抗坏血酸、丁二酸、防腐剂溶液、亚硫酸钠溶液、H2O2溶液、氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化锌、氯化钙、氯化铝、氯化铁、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、乳糖溶液，将定量色素浓缩液分别用配制好的上述溶液定容（1～100mL），以蒸馏水配制的色素液作为对照样，室温避光保存，定期检测吸光度A516nm。

1.2.4 桃金娘色素的高效液相色谱分离 采用Waters XBridgeTMC18柱，4.6×150mm，粒径5μm；柱温30℃，流速0.6mL/min；流动相为A：100%乙腈，B：0.1%三氟乙酸-水（V/V）；洗脱条件：0～5min，15%～20%A；5～10min，20%～23%A；10～15min，23%～25%A；15～20min，25%～28%A；20～23min，28%～15%A。Prostar320 PDA检测器，进样量10μL，检测波长520nm。

2 结果与分析

2.1 桃金娘红色素的溶解性及光谱特性

桃金娘红色素溶解性实验结果表明：桃金娘红色素易溶于水、乙醇、甲醇、盐酸等极性溶剂，难溶于乙醚、石油醚、丙酮、油脂、酯类、氯仿等非极性溶剂。色素在不同pH条件下的吸收光谱如图1所示。由图1可知，pH在1.0～6.0的范围内，色素有明显的吸收峰，pH为1.0～4.0的色素液吸收峰强度差别不大，说明桃金娘红色素在酸性条件下显色很好；pH为7.0～8.0时，色素溶液无显著吸收峰。目测结果表明，pH为 1.0～3.0时色素液为深红色，pH在4.0～6.0之间颜色变淡，pH8.0时呈紫褐色。结合溶解性和光谱实验结果，可初步判断桃金娘色素为花青素类色素[11]。

由图2可见，在pH1.0～7.0范围内，桃金娘色素液的吸光度随pH的上升而降低；在pH转碱范围内，其吸光度随着pH的上升而增加，这是因为花色苷形式由红色的黄烊盐转变为蓝色醌式碱所致[12]。为了在很好的显色条件下研究桃金娘红色素的其他理化性质，以后的实验中色素溶液的pH定为3.0。

图1 不同pH条件下桃金娘红色素的吸收光谱图Fig.1 Absorption spectrum of Rhodomyrtus tomentosa red pigment under different pH

图2 桃金娘色素在pH1.0～9.0的初始吸光度Fig.2 Initial absorbance of Rhodomyrtus tomentosa pigment under pH1.0～9.0

2.2 光照对桃金娘色素稳定性的影响

图3 不同pH对色素稳定性的影响（避光）Fig.3 Effect of different pH on pigment stability（obstacle light）

图3、图4为pH不同的桃金娘色素在不同光照条件的变化情况，由图3可见，在常温避光条件下，色素在pH1.0的条件下最稳定，随着pH的升高，稳定性呈下降趋势。由图4可知，常温光照条件下，色素降解的速度大于避光条件，且在pH1.0的条件下最稳定，pH3.0的条件下次之，pH5.0的条件下稳定性最差，且降解多发生在前10d内。由图5色素在不同pH下的残存率知，常温避光条件下，pH对色素稳定性的影响较大，pH1.0的色素液很稳定，pH2.0～4.0的色素液比较稳定，pH5.0～6.0的色素液稳定性差；在前5d内吸光度迅速下降，之后缓慢下降；而光照条件下色素的稳定性变差，尤其是pH大于4的样品，色素残存率下降更为剧烈，随着色素稳定性变差，结构变化，生成褐色物质，因而随着pH升高，吸光值又会逐渐上升。因此，该色素适合在pH1.0～4.0的酸性条件下使用。

图4 不同pH对色素稳定性的影响（室内自然光照）Fig.4 Effect of different pH on pigment stability（natural light）

图5 不同pH对色素稳定性的影响Fig.5 Effect of different pH on pigment stability

2.3 热处理对桃金娘色素稳定性的影响

桃金娘色素的热稳定性实验结果如表1所示。处理时间为3h，pH1.0的样品在温度加热到80℃时，溶液颜色无明显变化；pH3.0的样品加热到70℃，仍为透明的红色；pH5.0的样品70℃处理3h残存率较低。综合得出，pH1.0和pH3.0的色素液保留率较好。这说明在酸性条件下桃金娘红色素溶液对热比较稳定，色素降解率也很低。

表1 温度对色素的稳定性的影响Table 1 Effect of temperature on pigment stability

2.4 有机酸、氧化剂、还原剂、防腐剂对桃金娘色素稳定性的影响

由图6～图8可知，低浓度的山梨酸钾、苯甲酸钠（浓度＜0.2%）对桃金娘色素的吸光度影响较小，而高浓度的防腐剂造成色素吸光值略微上升，在食品工业允许添加的范围内均无明显不良影响。常用护色剂柠檬酸对色素具有较明显的辅色作用，酒石酸、苹果酸有较弱的辅色作用。低浓度的双氧水对色素具有明显的破坏作用，颜色均由深红色变为浅黄色。亚硫酸钠是食品加工、保藏中常用的漂白剂和防腐剂，一般认为花色苷能和亚硫酸氢盐发生加成或缩合反应，生成无色的化合物，使花色苷褪色[13]。

图6 有机酸、防腐剂对色素稳定性的影响Fig.6 Effect of organic acid and preservatives on pigment stability

图7 不同浓度氧化剂对色素稳定性的影响Fig.7 Effect of different concentrations of oxidants on pigment stability

图8 不同浓度还原剂对色素稳定性的影响Fig.8 Effect of different concentrations of reducing agent on pigment stability

2.5 不同金属离子对色素稳定性的影响

由表2金属离子对色素稳定性的影响可以看出，Ca2+、Zn2+在研究浓度范围内对色素稳定性无明显影响。K+、Na+在较高浓度下有一定增色效果，随浓度降低而减弱。低浓度的Mg2+溶液在短时间内对色素具有一定的增色作用，较高浓度则对色素有不良影响。较高浓度的Al3+对色素溶液有一定的增色作用，而当Fe3+浓度达到一定程度时，可能是因为Fe3+能和花色苷生成络合物，色泽鲜艳的紫红色溶液转变为褐绿色，由此可见，Fe3+对色素稳定性有显著的不良影响。结果表明部分金属离子可通过络合作用起到较好的辅色作用。

2.6 甜味剂、辅色剂对色素稳定性的影响

由图9可知，甜味剂在一定浓度内对桃金娘色素都有或多或少的增色作用，其中蔗糖增色作用最明显，随着甜味剂的浓度增大，增色作用减弱。由图10得到，常用的护色剂中没食子酸的增色护色效果明显，丁二酸没有明显影响，抗坏血酸对色素液没有辅色作用，相反，能引起色素的降解，且随着抗坏血酸的浓度增大，降解速度也加快，这可能是由于在有氧的条件下，抗坏血酸被氧化生成H2O2，进而促使花色苷降解[9]。

表2 金属离子对桃金娘色素稳定性的影响效果Table 2 Effect of metal ion on Rhodomyrtus tomentosa stability

图9 糖浓度对桃金娘色素稳定性的影响Fig.9 Effect of sugar concentration on Rhodomyrtus tomentosa

图10 有机酸对桃金娘色素的辅色性能Fig.10 Organic acid on the color performance of stability Rhodomyrtus tomentosa pigment

2.7 桃金娘色素的HPLC分析

由图11可以看出，纯化色素样中主要含有4类花色苷，峰1、峰2、峰3和峰4，保留时间分别为2.7727、3.3267、3.7801、5.0322min，含量分别占0.75%、5.94%、57.23%和36.07%，相对总含量大于样品的99%，判断桃金娘色素中主要含有4种花色苷。

图11 纯化样品的高效液相色谱图Fig.11 High performance liquid chromatography chart of purification samples

3 结论

3.1 桃金娘色素理化性质研究表明，桃金娘色素为水溶性色素，光谱特征也与花青素相似。

3.2 在pH小于4的条件下桃金娘色素稳定，色泽深红，吸收峰明显，pH大于4时色素变色吸收峰逐渐平缓。桃金娘色素耐热耐光性能较好，易于加工和贮藏；氧化剂和还原剂破坏色素的稳定性；在食品工业允许范围内，防腐剂、酸味剂、甜味剂等食品添加剂对桃金娘色素的稳定性无影响。

3.3 纯化色素样经过高效液相色谱进一步分离纯化表明桃金娘色素主要含有4种色素。

[1]Bridle P，Timberlake C F.Anthocyanins as natural food colorsselected aspects[J].Food Chemistry，1997，58（1）：103-109.

[2]Cristina Alcalde-Eon，Gloria Saavedra，Sonia de Pascual-Teresa，et al.Identification of anthocyanins of pinta boca（Solanum stenotomum）tubers[J].Food Chemistry，2004，86：441-448.

[3]Hvr W H，Man M.Two new truterpenoids from rhoddmyrtus tuimentosa[J].Phytochemistry，1976，115：1741-174.

[4]江彩华，方伟章，丁文恩，等.桃金娘保健饮料的开发研究[J].林业实用技术，2003（6）：10-11.

[5]Surasak L，Supayang P V.Boesenbergia pandurata（Roxb.）Schltr.Eleuthe rineamericana Merr.and Rhodomyrtus tomentosa（Aiton）Hassk.asantibiol Producing and antiquorum sensing in Streptococcu spyogenes[J].FEMS Immunol Med Microbiol，2008，53：429-436.

[6]陈火君，江晓燕.桃金娘开发应用研究进展[J].广东农业科学，2007（2）：109-111.

[7]张奇志，廖均元，林丹琼.桃金娘天然保健饮料开发研究[J].饮料工业，2008，20（11）：32-34.

[8]吴文.桃金娘、枸杞、红枣保健饮料的研制[J].饮料工业，2005，8（5）：17-19.

[9]Markakis P.Anthocyanins as food colors[M].San Diego：Academic Press，1982：163-207.

[10]邓洁红.刺葡萄皮色素的研究[D].长沙：湖南农业大学，2007.

[11]朱文学，吴龙奇，易军鹏，等.牡丹花红色素理化性质研究[J].农业工程学报，2006，22（6）：224-226.

[12]LT Dan，GR Takeoka，RH Edwards，et al.Improved method for the stabilization of anthocyenidins[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，1998，46：3564-3569.

[13]马自超，庞世珍.天然食用色素化学及生产工艺学[M].北京：中国林业出版社，1994：9-92.

Study on pigment stability and separation from Rhodomyrtus tomentosa

ZHANG Shao-min，CUI Chun*，ZHAO Mou-ming，CHEN Wen-fen
（College of Light Industry and Food，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China）

In order to provide theory and experimental data for the popularization and application of Rhodomyrtus tomentosa pigment（RTP），the stability and separation of RTP was investigated.The results indicated that，this pigment was easily dissolved in acidic aqueous solution or acid alcohol solvent，insoluble or hardly soluble in non-polar solvents.In the buffer solution，RTP was stable when the solution pH value was lower than 4.0，the maximum absorption wavelength of RTP was 516nm.It was found that the red pigment resistant to common food additives，such as carbohydrate，organic acid，sodium benzoate，potassium sorbate.The pigment was poor resistant to light，heat，reduct，oxide.It was stable to metal ions such as：Zn2+，K+，Al3+，Na+，Ca2+，which could add its color or could not badly affect it while Mg2+，Fe3+could change its color.HPLC showed that there were four main pigments in RTP.

Rhodomyrtus tomentosa；pigment；stability；separation

TS202.3

A

1002-0306（2012）05-0299-05

2011－04－06 *通讯联系人

张少敏（1987-），女，硕士研究生，研究方向：食品生物技术。

国家863计划重点项目（2007AA100404）；广东省教育部产学研结合项目（2009B090600120）。