配方奶粉中核苷酸含量高效液相色谱测定

高运华， 黎 朋， 侯东军， 张 玲， 王 晶

（1.中国计量科学研究院，北京 100013；2.中国动物疫病预防控制中心，北京 100125）

0 引言

核苷酸具有提高人体免疫力、促进细胞再生与修复等生理功能[1]，配方奶粉中添加核苷酸已经成为国际共识。而奶粉的质量关系到千千万万婴幼儿的健康成长[2]，关系到我国的社会稳定，大头娃娃事件、三聚氰胺事件等和其他婴幼儿奶粉相关事件无不是关系到国家安定和国家荣誉的重大事件。目前，核苷酸的定量检测方法主要包括高效液相色谱法、高效毛细管电泳法及高效液相色谱-质谱联用法等[3-5]。试样的前处理方法则包括固相萃取法、水解法、酶解法和沉淀杂质法等[6-7]。高效液相色谱及高效毛细管电泳法利用核苷酸具有紫外吸收的特性，采用紫外检测器进行检测，具有重现性好、成本较低等优点。其中，高效液相色谱法发展迅速、应用面广，适用性远大于高效毛细管电泳法。虽然高效液相色谱-质谱联用法具有更高的准确性和灵敏度，然而该方法的成本高、局限性较大，制约了其广泛应用。固相萃取法的应用范围广，但存在步骤繁琐、误差大、重现性不高等问题[8]。该方法使用酸和碱分别沉淀样品中的检测干扰成分如蛋白质和糖类等，采用高效液相色谱法测定核苷酸含量，相比于水解、固相萃取法测定更准确，相对于质谱法测定更简便快捷，成本更低，重复性、适用性好，适于更广泛的核苷酸测定。

1 实验部分

1.1 仪器设备

高效液相色谱仪（Agilent1200，Agilent公司）；离心机（Sigma 3k15）；天平（赛多利斯 0.01 mg）；pH计（奥立龙）；超纯水系统（Milliber QS型，Milliber公司）。

1.2 材料试剂

腺嘌呤核苷一磷酸（AMP）标准物质（GBW（E）100154）、胞嘧啶核苷一磷酸（CMP）标准物质（GBW（E）100067）、鸟嘌呤核苷一磷酸二钠盐（GMP.2Na）标准物质（GBW（E）100068）、尿嘧啶核苷一磷酸二钠盐（UMP.2Na）标准物质（GBW（E）100069）、次黄嘌呤核苷一磷酸二钠盐（IMP.2Na）标准物质（GBW(E)100181）、甲醇（色谱纯）、乙酸（优级纯）、磷酸二氢钾（分析纯）、氢氧化钾（分析纯）、奶粉样品（市售）。

1.3 标准溶液配制

将核苷酸标准物质于80℃干燥过夜，使用0.01mg天平重量法配制成1mg/g标准贮存溶液。再使用精度为 0.01mg天平，用1mg/g标准溶液配制成5种核苷酸混合标准工作溶液。

1.4 奶粉样品配制

用精度为0.1 mg天平称量15 mL离心管质量，然后称量约0.5g奶粉样品至该离心管中，加入50℃超纯水约4g，充分震荡混匀，平衡至室温。用精度为0.1mg天平称取核苷酸混合标准溶液分别加入到不同的奶液中，同时配制空白对照。

1.5 核苷酸的提取

往1.4配制的奶液中分别按体积分数0.5%、1%、2%、3%、4%、5%比例加入冰乙酸溶液，震荡混匀，放置20min。使用精度为0.1mg天平用重量法加超纯水定容至10 g溶液，然后6000r/min离心10min。将上清液转移至另一个离心管，用10mol/L氢氧化钾调节溶液的pH值至7～8之间，混匀后放置20min，6000r/min离心10 min。取上清液用0.22 μm滤膜过滤后，储存于4℃冰箱待分析。

1.6 核苷酸高效液相色谱分离分析

采用耐水性的色谱柱，磷酸盐做为流动相，DAD检测器，用保留时间进行定性，峰面积进行定量，对配方奶粉中的核苷酸进行了定量分析。

2 结果与讨论

2.1 5种核苷酸液相色谱分离分析条件的优化

用核苷酸标准物质作为样品，通过优化色谱分离分析条件，完成了5种核苷酸高效液相色谱的有效分离分析。

2.1.1 色谱条件

色谱柱为Ailent ZORBAX SB-Aq 4.6×250mm；流速为1.0 mL/min；柱温为30℃；检测器为DAD检测器；样品浓度为1 mg/mL；进样体积为10 μL。检测波长 AMP为 257 nm，CMP为 280 nm，UMP为262nm，IMP.2Na为249nm，GMP.2Na为254nm。

2.1.2 流动相及梯度条件

流动相由两部分组成，分别为：

流动相A：100mmol/L磷酸二氢钾溶液，pH=5.6；

流动相B：100mmol/L磷酸二氢钾溶液，pH=5.6，20%（ν/ν）甲醇。

流动相梯度变化见表1。

表1 奶粉中核苷酸含量测量色谱梯度洗脱条件

5种核苷酸相互之间达到了基线分离，峰型对称性较好，各核苷酸之间不互为杂质，分离分析结果见图1。由图1可以看出利用文中色谱分离条件可以较好地实现5种核苷酸标准的有效分离，满足了定量测量的需要。

图1 5种核苷酸标准高效液相色谱分离分析

2.2 奶粉样品中干扰组分的去除及5种核苷酸液相色谱分离分析

利用酸、碱沉淀和高速离心相结合的方法对奶粉中影响核苷酸检测的其他组分进行了有效去除研究。考察了不同酸度对奶粉样品中其他成分的去除情况，发现不同酸度处理样品杂质峰影响待测核苷酸的数量不同。酸沉淀后，调节溶液的pH至碱性，可以有效去除另外一些干扰组分，结果见表2。此外考察了不同的离心力对样品干扰组分去除的情况，发现6000r/min以上的离心处理可以有效去除干扰组分，结果见图2。

表2 乙酸浓度对检测的影响

图2 奶粉中5种核苷酸高效液相色谱分离分析

2.3 标准曲线线性回归方程、相关系数及线性范围

利用5种核苷酸标准物质配制成浓度为1mg/mL标准储备液，然后配制核苷酸标准溶液于容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀。以质量浓度（C）为横坐标，相应峰面积（A）为纵坐标，绘制标准曲线，线性回归方程、相关系数及取0.5 g样品各核苷酸的检出限见表3。

表3 5种核苷酸的标准曲线回归方程、相关系数及方法检出限

由表3的数据可以看出标准系列的线性较好，可以作为定量的依据。在线性范围内，配制合适的5种核苷酸标准溶液，测定其信号强度为噪声3倍时的核苷酸含量，作为方法的检出限，5种核苷酸的方法检出限均不大于0.15 μg/g，完全满足测量的要求，可以对奶粉样品中不同含量的核苷酸进行定量测量。

2.4 方法的准确度

方法准确性采用标准添加测定回收率实验，以不含上述5种核苷酸的奶粉样品为本底，平行称取7份，分别往其中加入5种核苷酸低浓度混标和高浓度混标，对上述7份样品进行前处理，平行测定3次，以评价该方法的准确度，结果见表4。

表4 5种核苷酸加标回收率结果（n=7）

表5 实验室内精密度和重复性

表6 实验室室间精密度和再现性

表4数据表明，核苷酸加标回收率在90.8%～99.3%之间，说明该方法准确度较好、可行性强、易于掌握。

2.5 方法的精密度、重复性和再现性

2.5.1 室内精密度和重复性

在对方法进行验证的过程中，对奶粉等样品中核苷酸含量进行了测试。具体试验结果如表5所示。

分析表5数据可以看出，方法的室内精密度和重复性限均较好，满足了定量分析的要求。

2.5.2 室间精密度和再现性

选择7家实验室进行了实验室间的验证。以不同的2个奶粉样品为考察对象进行测试，实验结果见表6所示。

分析表6数据可以看出，方法的实验室间精密度和再现性限均较好，满足了定量分析的要求，并且说明该方法的适用性较好。

3 结束语

研究建立了定量测定婴幼儿奶粉中腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、次黄嘌呤等5种核苷一磷酸的高效液相色谱方法，方法的测量精度较高，重复性较好，并且成本大大降低。方法的技术参数满足了奶粉中核苷酸定量测量的需求，为奶粉中核苷酸含量的定量测量及相关产品的质量技术监督检验提供了方法学依据。

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