白藜芦醇对视网膜母细胞瘤Y79细胞增殖的影响及其机制

张千帆 刘瑞敏 穆红梅 郭 洋 申 飞 刘 莹

视网膜母细胞瘤(retinoblastoma，RB)是婴幼儿中最常见的眼内恶性肿瘤，严重危害患者的视力和生命，约84%发生于3岁前，若能给予及时治疗，患儿存活率可达95%[1]。近年来随着RB治疗方法的不断改进，人们更关注的不再是降低死亡率，而是保留患者的眼球和有用视力来提高患者生存质量，因此寻找行之有效的化疗药物具有十分重大的意义[1-2]。白藜芦醇(resveratrol，Res)是近年来发现的非黄酮类多酚化合物，有研究证实其能够杀死多种肿瘤细胞[3]，但尚未见其对人RB细胞系作用的报道。本文旨在研究Res对人RB Y79细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响，并探讨其抗肿瘤活性的机制，为其临床应用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 人RB Y79细胞株购自中国科学院上海细胞所细胞库。RPMI 1640培养基购自Gibco公司。小牛血清购自杭州四季青公司。Res购自Sigma公司，Annexin V-FITC、碘化丙啶(propidium iodide，PI)染料和二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)试剂购自Sigma公司。NF-κB/p65、Survivin和 β-actin抗体均购自Santa Cruz公司(美国)。辣根过氧化酶标记物山羊抗小鼠IgG(二抗)和碱性磷酸酶显色试剂盒购于北京中山生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和药物处理 Y79细胞接种于含体积分数15%胎牛血清的RPMI 1640培养液中(含100×103U·L－1青霉素和链霉素)。置37℃、含体积分数5%CO2、饱和湿度的恒温培养箱中传代培养，取对数生长期细胞用于实验。Res用DMSO溶解配制为100 mmol·L－1，过滤除菌后－20℃保存备用。

1.2.2 细胞计数法检测Res对Y79细胞增殖的抑制作用 取对数生长期的Y79细胞，调整细胞浓度为109L－1接种于24孔板。加入含Res终浓度为25 μmol· L－1、50 μmol· L－1、100 μmol· L－1、200 μmol·L－1的 RPMI 1640 完全培养基，同时设置阴性对照和空白对照，每组均设3个复孔。继续培养24 h、48 h、72 h。结束培养进行细胞计数，细胞增殖抑制率=(对照组细胞数－给药组细胞数)/对照组细胞数×100%。

1.2.3 流式细胞仪检测细胞周期和凋亡 收集100 μmol·L－1Res作用0 h、24 h、48 h、72 h 后的 Y79 细胞，每组收集106个细胞，轻轻吹打制备单细胞悬液细胞。悬液细胞移入1.5 mL离心管，4℃、500 r·min－1离心5 min。小心移去上清液，冰预冷PBS洗细胞2次，以体积分数70%冷乙醇4℃固定4 h。再以PBS洗细胞2次以上去除乙醇，流式细胞仪单染检测周期、双染检测凋亡进行参数获取和资料分析，计算细胞周期和凋亡率。

1.2.4 Western-blot检测 Res对 Y79 细胞 NF-κB/p65和Survivin蛋白表达的影响 取对数生长期Y79细胞接种于6孔细胞培养板上，收集100 μmol·L－1Res作用0 h、24 h、48 h、72 h 后的 Y79 细胞提取细胞总蛋白。总蛋白经Bio-Rad测定浓度后SDSPAGE凝胶电泳分离，电转移至PVDF膜上。加稀释一抗抗体(靶蛋白抗体)静置过夜，第2天TBST漂洗，加入二抗(山羊抗小鼠IgG)孵育，荧光显色，冲洗。扫描蛋白印迹胶片后用Scion图像分析系统(4.02版本)分析条带影像，按照靶蛋白/β-actin蛋白比例来代表目的基因相对表达量。

1.3 统计学方法 数据应用 SAS 6.12和 SPSS 13.0统计软件进行处理，MTT结果采用SAS 6.12两因素方差分析，RT-PCR结果采用单因素方差分析。检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 Res对Y79细胞增殖的影响 Res对人RB Y79细胞增殖的影响见图1，由图1可以看出:Res具有显著抑制人RB Y79细胞增殖的作用，并呈浓度依赖性和时间依赖性;不同浓度间、不同时间点间生长抑制率差异有显著统计学意义(F=25.436，P ＜0.01)。

Figure 1 Cytostatic time and dose relationship of Res Res抑制Y79细胞增殖的时效和量效关系

2.2 Res对 Y79细胞周期的影响 经100 μmol·L－1Res作用24 h、48 h、72 h后的Y79细胞S期细胞比例明显增加，分别增加至(44.51±4.65)%、(55.41±3.14)%、(63.17 ±3.96)%，与 0 h 的(32.69±4.28)%比较，不同时间点间差异有显著统计学意义(F=36.439，P ＜0.01);G0/G1期细胞比例明显降低，分别降低至(47.18 ±3.52)%、(39.46 ±4.13)%、(32.61±4.68)%，与 0 h的(54.24±5.00)%比较，不同时间点间差异也有显著统计学意义(F=18.296，P ＜0.01)。

2.3 Res对 Y79细胞凋亡的影响 经100 μmol·L－1Res作用 24 h、48 h、72 h 后，细胞凋亡率分别增加至(6.27 ±3.36)%、(11.13 ±4.04)%、(16.99 ±3.65)%，与0 h的(1.18 ±1.17)%相比，不同时间点间细胞凋亡率差异有显著统计学意义(F=12.927，P＜0.01)。表明Res对Y79细胞具有诱导凋亡作用，且呈时间依赖性。

2.4 Res对 Y79 细胞 NF-κB/p65 和 Survivin 蛋白表达的影响 Res对 Y79细胞 NT-κB/p65和 Survivin蛋白表达的影响见图2，由图2可以看出:经100 μmol·L－1Res作用24 h、48 h、72 h 后Y79 细胞NF-κB/p65蛋白表达明显降低，分别降低至0.44±0.10、0.37 ±0.10、0.24 ±0.09，与0 h 的0.53 ±0.09比较，不同时间点间差异有统计学意义(F=5.035，P ＜0.05);100 μmol·L－1Res 作用 24 h、48 h、72 h后Y79细胞Survivin蛋白表达明显降低，分别降低至0.62 ±0.11、0.43 ±0.11、0.24 ±0.09，与 0 h 的0.73±0.12比较，不同时间点间差异有显著统计学意义(F=9.571，P ＜0.01)。

Figure 2 NF-κB/p65 and Survivin protein expressions after treated with 100 μmol·L －1Res at different time 100 μmol·L －1Res 作用不同时间后Y79细胞NF-κB/p65和Survivin蛋白的表达

3 讨论

Res又称芪三酚，是一种含有芪类结构非黄酮类多酚化合物，是植物为抵抗外界刺激(如紫外线、真菌、病毒感染等)而产生的一种植物抗毒素[4]。Res在植物中分布广泛，在70多种植物中都发现有Res的存在。Res具有保护心血管和调节血脂及抗病原微生物等多种生物学作用。而且近年来研究表明，Res对消化和呼吸及生殖等多个系统来源的多种肿瘤都有抗肿瘤作用[5-7]，但对于其抑制肿瘤细胞增殖的具体机制尚不完全明了。本研究证实Res对人RB Y79细胞有显著的增殖抑制的作用，并呈浓度和时间依赖性。

由于失控性过度增殖是肿瘤细胞的一大特性，因而细胞周期调控紊乱导致细胞增殖过多和凋亡过少与肿瘤发生发展的关系一直是肿瘤防治研究中的热门课题。本实验观察了Res对RB Y79细胞周期的影响，结果发现Res作用后RB Y79细胞S期细胞比例明显增加;G0/G1期细胞比例明显降低，表明Res可有效地阻滞RB Y79的细胞周期。细胞凋亡是机体维护内环境稳定的正常生理过程，是正常细胞衰老、死亡过程的主要形式。研究表明，肿瘤细胞的凋亡异常与肿瘤发生发展密切相关，因而通过各种方法诱导肿瘤细胞的凋亡是抗肿瘤研究的热点之一[8-10]。为此本实验观察了Res对RB Y79细胞凋亡的影响，结果发现Res作用后RB Y79细胞的凋亡率高于对照组，呈时间依赖性上升，表明Res可有效地诱导RB Y79细胞的凋亡。凋亡是多种基因参与的病理生理过程。肿瘤细胞的凋亡异常与凋亡相关基因表达异常密切相关。Survivin是迄今为止发现的抑制凋亡作用最强的、研究最为广泛的基因[11]。为探讨Res诱导RB Y79细胞凋亡的分子机制，我们观察了Res作用后Y79细胞中凋亡抑制蛋白Survivin蛋白表达的变化。结果显示，Res作用于Y79细胞可引起Survivin蛋白表达的下调，随着时间的延长，表达的下调作用更为显著。提示Res诱导Y79细胞凋亡的作用是通过抑制Survivin的表达来起作用的。

转录是基因表达调控的一个主要环节，核转录因子是指与DNA上一些特定序列相结合从而调节转录活性和基因表达水平的因子。核因子NF-κB是1986年首次从成熟的B淋巴细胞中抽提出的核因子[12]。NF-κB 最常见的是 P50/P65 二聚体，当受到外界刺激时，P50/P65复合体解离，P65进入细胞核，诱导相关基因的表达。目前的许多研究表明，它不仅能够参与免疫和炎症多种生理过程，而且参与肿瘤细胞增殖和凋亡以及血管生成等病理过程[13]。我们观察了Res作用后Y79细胞中NF-κB/p65蛋白表达的变化，结果显示，Res作用于Y79细胞可呈时间依赖性引起NF-κB/p65蛋白表达的下调，提示Res诱导Y79细胞凋亡的作用与抑制NF-κB/p65的表达密切相关。

本研究结果表明，Res可望成为临床上治疗RB的有效药物或辅助用药，但其作用途径和机制尚需进一步研究。

1 Thiyagarajan S，Thirumalai K，Nirmala S，Biswas J，Krishnakumar S.Effect of curcumin on lung resistance-related protein(LRP)in retinoblastoma cells[J].Curr Eye Res，2009，34(10):845-851.

2 Trinavarat A，Chiewvit P，Buaboonnam J，Sanpakit K，Atchaneeyasakul LO.Selective ophthalmic arterial infusion of chemotherapeuticdrugs for recurrent retinoblastoma[J].J Pediatr Hematol Oncol，2012，34(6):e218-221.

3 Lopez-Lluch G，Cruz-Calvo SS，Navas P.Resveratrol in cancer:cellular and mitochondrial consequences of proton transport inhibition[J].Curr Pharm Des，2012，18(10):1338-1344.

4 Fabre KM，Saito K，DeGraff W，Sowers AL，Thetford A，Cook JA，et al.The effects of resveratrol and selected metabolites on the radiation and antioxidant response[J].Cancer Biol Ther，2011，12(10):915-923.

5 Athar M，Back JH，Kopelovich L，Bickers DR，Kim AL.Multiple molecular targets of resveratrol:Anti-carcinogenic mechanisms[J].Arch Biochem Biophys，2009，486(2):95-102.

6 Mo W ，Xu X，Xu L，Wang F，Ke A，Wang X，et al.Resveratrol inhibits proliferation and induces apoptosis through the hedgehog signaling pathway in pancreatic cancer cell[J].Pancreatology，2011，11(6):601-609.

7 Stakleff KS，Sloan T，Blanco D，Marcanthony S，Booth TD，Bishayee A.Resveratrol exerts differential effects in vitro and in vivo against ovarian cancer cells[J].Asian Pac J Cancer Prev，2012，13(4):1333-1340.

8 Inoue-Yamauchi A，Oda H.Depletion of mitochondrial fission factor DRP1 causes increased apoptosis in human colon cancer cells[J].Biochem Biophys Res Commun，2012，21(1):81-85.

9 Lu X，Qian J，Zhou H，Gan Q ，Tang W ，Lu J，et al.In vitro cytotoxicity and induction of apoptosis by silica nanoparticles in human HepG2 hepatoma cells[J].Int J Nanomedicine，2011，6:1889-1901.

10 Pan D，Li Y，Li Z，Wang Y，Wang P，Liang Y.Gli inhibitor GANT61 causes apoptosis in myeloid leukemia cells and acts in synergy with rapamycin[J].Leuk Res，2012，36(6):742-748.

11 Knauer SK，Heinrich UR，Bier C，Habtemichael N，Docter D，Helling K，et al.An otoprotective role for the apoptosis inhibitor protein survivin[J].Cell Death Dis，2010，1:e51.

12 Sen R，Baltimore D.Inducibility of kappa immunoglobulin enhancer-binding protein Nf-kappa B by a posttranslational mechanism[J].Cell，1986，47(6):921-928.

13 Xie CY，Yang W，Ying J，Ni QC，Pan XD，Dong JH，et al.B-cell lymphoma-2 over-expression protects δ-elemene-induced apoptosis in human lung carcinoma mucoepidermoid cells via a nuclear factor kappa B-related pathway[J].Biol Pharm Bull，2011，34(8):1279-1286.