穿山龙薯蓣皂苷酶酶学性质研究

赖 颖，赵锦慧

（周口师范学院 生命科学系，河南 周口 466001）

穿山龙为薯蓣科植物穿龙薯蓣的干燥根茎，又名野山药、串地龙、地龙骨，药用部分为根茎［1］.穿山龙味苦、性平、归肝肺经、功效祛风除湿、活血通络、止咳平喘.主要用于治疗风寒湿痹、肌肤麻木、筋骨疼痛、关节屈伸不利、跌打损伤、瘀滞作痛、冠心病、痰多咳喘等症.主要分布于辽宁、吉林、黑龙江、河北、内蒙、陕西、山西等省份［2］.

穿山龙含丰富的薯蓣皂苷（Diosein）［3］，薯蓣皂苷经代谢产生的薯蓣皂苷元是发挥作用的成分.低糖基的穿山龙薯蓣皂苷元会被生命体所吸收，发挥疗效.穿山龙薯蓣皂苷酶能够特异性地水解穿山龙薯蓣皂苷上的鼠李糖基，生成低糖基穿山龙薯蓣皂苷.获得皂苷水解酶主要有2种途径，一是从植物或者动物中直接提取；二是通过微生物发酵.然而，当前国内外的研究多集中在通过筛选产穿山龙薯蓣皂苷酶微生物，实现对穿山龙薯蓣皂苷糖苷酶的发酵生产，从动物中直接提取的酶方面的相关报道非常少.笔者从动物源牛肝中提取得到较高活力的穿山龙薯蓣皂苷酶，并对该酶的部分酶学性质进行了研究，旨在为合理开发利用该酶奠定基础.

1 材料与方法

1.1 实验材料、主要试剂与仪器

1.1.1 实验材料

新鲜牛肝1 000g，穿山龙干粉1 000g.

1.1.2 主要试剂

醋酸钠，正丁醇，硫酸铵，硫酸，氯化钾，聚丙烯酰胺.以上试剂均为分析纯.

1.1.3 仪器

集热式磁力搅拌仪，精密酸度仪，数显恒温水浴锅，真空泵，冷冻离心机.

1.2 酶的提取

称取500g新鲜的牛肝放入搅拌器，加入3倍体积的 HAc－NaAc缓冲液（0.02mol／L，pH5.0），搅拌成糊状后，倒入洗净的烧杯中，将烧杯放入冰水中沉淀30～40min，用高速冷冻离心机在8 000 r／min，4℃下离心10min，除去杂质，收集含酶的上清液.依次用不同饱和度的硫酸铵进行沉淀.

1.3 测酶活力的方法

各取0.1mL穿山龙底物与酶液混合，在特定条件下反应4h后用0.2mL水饱和正丁醇终止酶反应，摇匀，静止使其分层，取上层溶液作薄板层析，每个点点样量为10μL，展开剂为V（氯仿）∶V（甲醇）∶V（水）＝7∶3∶0.5.喷硫酸显色后扫描打印，应用工具软件BandScan分析图片.

1.4 牛肝源穿山龙皂苷酶酶学性质研究

1.4.1 最适硫酸铵饱和度的确定

分别取饱和度为40%，45%，50%，55%，60%，65%，70%的硫酸铵沉淀的酶液0.1mL与0.1mL的底物混合，于37℃下反应12h，然后加入0.2mL水饱和正丁醇终止反应，作薄层层析检测酶活，看底物的水解情况.

1.4.2 酶反应的最适时间

在最佳底物浓度的基础上，各取0.1mL穿山龙底物与酶液混合，分别于37℃下反应0.5h，1 h，1.5h，2h，2.5h，3h，3.5h，4h，6h，8h，然后作薄层层析检测，看底物的水解情况.

1.4.3 酶反应的最适温度

在上述最佳条件下，各取0.1mL穿山龙底物与酶液混合，分别于32℃，37℃，42℃，47℃ ，52℃，57℃下反应.然后作薄层层析检测，看底物的水解情况.

1.4.4 酶反应的最适底物浓度

分别配制底物浓度为0.2%，0.3%，0.4%，0.5%，0.6%，0.8%，1.0%，1.2%，2.0%，3.0%的10种穿山龙底物，各取0.1mL穿山龙底物与酶液等比例混合，于42℃下反应4h，然后作薄层层析检测，看底物的水解情况.

1.4.5 酶反应的最适pH值

分别配制0.02mol／mL的pH值为4.0，4.4，4.8，5.2，5.6的 HAc－NaAc缓冲溶液，再分别用各缓冲溶液溶解底物穿山龙，在上述最佳条件下与酶液反应，然后作薄层层析检测，看底物的水解情况.

2 结果与分析

2.1 硫酸铵分级沉淀牛肝源穿山龙皂苷酶的最适浓度

用不同饱和度硫酸铵沉淀的酶液与穿山龙底物反应，在薄层层析板上反应生成物和反应底物斑点浓度大小的图像如图1所示.

图1 分级沉淀的酶对穿山龙皂苷酶酶活的影响

图1产物层析位点的大小代表产物的多少，产物越多点越大，反应越完全，也就代表转化率越高.通过图1和表2可知：硫酸铵饱和度为55%沉淀的酶有较强的催化能力，转化率较高.

表1 硫酸铵饱和度浓度配比对酶反应转化率的影响

2.2 酶反应的最佳底物浓度

配制穿山龙的底物浓度分别为0.2%，0.3%，0.4%，0.5%，0.6%，0.8%，1.0%，1.2%，2.0%，3.0%，各取0.1mL与等量的酶液进行反应，然后进行薄层层析，测定酶活力如图2所示：

图2 穿山龙皂苷酶与不同浓度底物反应的薄层层析图

表2 底物浓度对酶反应转化率的影响

由以上数据可得出结论：穿山龙皂苷酶反应的最佳底物浓度为2.0%.

2.3 酶反应的最佳时间

取0.1mL浓度为2%的底物与酶液1∶1混合，置于40℃下分别反应0.5h，1h，1.5h，2h，2.5h，3h，3.5h，4h，6h，进行薄层层析，测定酶活力.如图3所示：

图3 酶反应不同时间的薄层层析图

分析以上数据得：反应4h时产物转化率最高，为最佳反应时间.

表3 酶反应时间对酶反应转化率的影响

2.4 酶反应的最适温度

在上述确定的最适条件下，各取0.1mL 0.2%底物溶液与酶液混合，分别于32℃，37℃，42℃，47℃，52℃，57℃下反应，进行薄层层析，测定酶活力，以确定酶反应最适温度，结果见图4.

图4 酶反应不同温度时的薄层层析图

表4 酶反应最适温度对酶反应转化率的影响

分析以上数据可知：穿山龙皂苷酶反应的最适温度为42℃.

2.5 酶反应的最适pH值

分别配制0.02mol／mL pH值分别为4.0～5.6的缓冲溶液，再用各个缓冲液溶解底物，在上述条件下反应，然后做薄层层析，测定其酶活力，确定最适的pH值，如图5所示.

分析以上数据可知：酶反应的最适pH值为5.2.

表5 酶反应最适pH对酶反应转化率的影响

图5 酶反应不同pH的薄层层析图

3 讨论

本文对由动物产的穿山龙薯蓣皂苷酶的部分酶学性质进行了研究.由于采用的是来源于动物器官的酶，因此需要进行前期的原料保存、原料破碎、细胞破碎等预处理，预处理过程繁琐且容易出现变质的问题.因此，笔者认为可以选取微生物来源的酶代替动物源的酶作用于底物，可以简化实验前期的处理过程.实验中笔者发现，穿山龙底物在该酶的作用下，不同的反应时间所生成的产物的种类有所不同，当反应时间小于2h产物分子量偏大，终产物的量较少，当反应大于2h产物的分子量偏小，终产物量增加.本实验的最佳反应时间为4h，因此，推测该酶可能是一种外切酶.本文中对于该酶的酶反应机理不甚明了，还有待于今后对酶的结构和性质的深入研究得以阐述清楚.

［1］Angulo P，Lindor KD.Treatment of nonalcoholic fatty liver：present and emerging therapies［J］.Semin Liver Dis，2001，21（1）：81－88.

［2］张克义，常天辉，李伯坚，等.穿山龙冠心宁及水溶性皂甙对小鼠心肌营养性血流量的影响［J］.中国医科大学学报，1982，11（3）：10.

［3］Yoneda M，Fujita K，Iasaki T，et a1.Treatment of NASH：nutritional counseling and physical exercise［J］.Nippon Rinsho，2006，64（6）：1139－1145.