复方银杏叶制剂对酒精性肝损伤的防护作用及机制

潘苏华，刘平平，刘亚锋，高 青

(1.南京中医药大学药学院江苏省中药药效与安全评价重点实验室，江苏南京 210046;2.郑州澍青医学高等专科学校，河南郑州 450064)

有关银杏叶提取物(Ginkgo biloba extract，GBE)对肝的影响文献报道不一［1-2］，为提高银杏叶制剂的安全用药，依据中药配伍减毒理论用刺梨与GBE配伍研制了复方银杏叶制剂(compound Ginkgo biloba，CGB)，并对 CGB 进行了化学性［3］、免疫性［4］肝损伤防护作用研究，结果提示CGB有显著的肝脏保护效应。本研究采用酒精性肝损伤模型，进行CGB肝损伤防护作用与氧化应激相关性研究，探讨CGB对酒精性肝损伤的保护效应及初步机制。为CGB应用于酒精性肝损伤的预防及辅助治疗提供科学依据，同时为银杏叶制剂安全用药提供参考。

1 材料与方法

1.1 动物

SD大鼠，雄性，135只，体质量160～220 g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。动物许可证号:SCXK(沪)2007-2005。

1.2 药品与试剂

GBE购自邳州富伟生化制品有限公司，批号:091116;刺梨汁粉由本室制备，批号:090910。CGB由本室制备，批号:091126，主要成分由GBE与刺梨汁粉按1∶1比例加水配制而成，其有效成分为每100 g含黄酮醇苷≥4.8%、银杏内酯≥1.2%;体积分数为0.56的红星二锅头购自北京红星股份公司;丙氨酸氨基转移酶(alamine aminotransferase，ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)试剂盒均购自南京建成生物工程公司;氯唑沙宗(批号:017K1385)和氨苯砜(批号:01915CE)对照品均购自Sigma公司;内标替硝唑对照品由中国药品生物制品检定所提供，批号:130351-200102;甲醇、乙腈均为色谱纯;二氯甲烷为分析纯;超纯水由Millipore超纯水系统制备。联苯双酯(bifendate，Bif)，批号:08040103，购自北京协和药厂。

1.3 仪器

VITROS 950型全自动生化分析仪(美国强生公司);DMLS2型光学显微镜(德国 LEICA公司产品);Biofuge型高速冷冻离心机(德国Heraeus公司);DY89-Ⅰ型电动玻璃匀浆机(德国IKA公司);JEM-1200EX型透射电镜(日本电子公司);1100型高效液相色谱仪(包括DAD检测器和化学工作站)(美国安捷伦公司)，AL-104型电子天平(瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司)。

1.4 动物分组给药

参照文献［5］方法，大鼠随机分为7组:正常对照组，模型组，GBE 0.8 g·kg-1组，CGB 2.4，0.8 和0.4 g·kg-1组，Bif 0.15 g·kg-1组，正常对照和模型组每组23只，其余组各15只。除正常组外各组大鼠用白酒-玉米油混悬液 ig造模，玉米油为2 ml·kg-1，白酒剂量第 1 周 18 ml·kg-1，第 2 周22 ml·kg-1，第 3 周起 27 ml·kg-1。正常对照组大鼠ig等体积生理盐水;造模同时分别ig各相应药物，每天1次，持续10周，10周后取其中7只大鼠测定血清ALT，AST及肝匀浆MDA，SOD和GSH水平，进行肝组织病理［6］及肝线粒体超微结构观察。

1.5 高效液相色谱法测定氯唑沙宗和氨苯砜的血药浓度

另取正常对照组及肝损伤模型组大鼠各8只，分别ig给予CYP2E1探针药氯唑沙宗50 mg·kg-1和CYP3A4探针药氨苯砜20 mg·kg-1，于给药前及给药后5，10，15和30 min，1，2，3，4，6，8，12，16和24 h经眼底静脉丛采血制备血浆，-20℃保存待测。随后ig给予CGB 25 mg·kg-1，连续7 d，再按上述方法给予相同剂量的探针药相同时间点采血，制备血浆，按文献［7-8］方法进行血样预处理，并用高效液相色谱法测定氯唑沙宗和氨苯砜的血药浓度。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 银杏叶制剂对肝损伤大鼠肝功能的影响

由表1以可看出，与正常对照组相比，模型组大鼠血清AST和ALT水平显著升高(P＜0.01);与模型组比较，CGB 2.4 和0.8 g·kg-1组AST 和ALT 显著下降(P ＜0.05)。

Tab.1 Effect of compound Ginkgo biloba(CGB)on contents of AST and ALT in plasma of alcohol induced liver injuried rats

2.2 CGB对肝损伤大鼠肝组织MDA含量，SOD和GSH活性的影响

由表2可见，与正常对照组比较，模型组肝匀浆GSH和SOD明显降低，MDA显著升高(P＜0.01)。与模型组比较，CGB 2.4和 0.4 g·kg-1组 MDA 显著降低(P ＜0.05，P ＜0.01)，CGB 2.4 和 0.8 g·kg-1组SOD和GSH 均显著升高(P＜0.05，P ＜0.01)。

Tab.2 Effect of CGB on MDA，SOD and GSH activities in liver homogenate of alcohol-induced liver injury rats

2.3 银杏叶制剂对肝损伤大鼠肝病理组织学影响

表3及图1结果显示，正常组大鼠肝小叶结构正常，肝索排列整齐，肝窦正常，肝细胞无明显病变，核圆，位于细胞中央，细胞质丰富核结构清晰(图1A);模型组大鼠肝细胞存在明显的肝细胞脂肪变，部分细胞呈片状水肿，大量细胞存在嗜酸性变，部分汇管区见炎症细胞浸润和散在坏死灶(图1B)。与正常对照组比较，模型组肝细胞脂肪变性程度有显著性加重(P ＜0.01)。CGB 0.8 g·kg-1组大鼠肝细胞存在轻、中度脂肪变性，少部分细胞存在嗜酸性变，炎症细胞浸润和细胞坏死情况少见(图1C，D)。其中CGB 2.4和0.8 g·kg-1组脂肪变程度较模型组有不同程度减轻，且有显著性差异(P＜0.05)。CGB 0.4 g·kg-1和 GBE 0.8 g·kg-1组大鼠肝细胞部分细胞可见片状水肿和嗜酸性变(图1D，E)Bif 0.15 g·kg-1轻度脂肪变性，少见炎症细胞浸润和坏死，与模型组比较有显著性差异(P＜0.01)。

Tab.3 Effect of CGB on the degree of steatosis in alcoholinduced live injured rats

2.4 银杏叶制剂对肝损伤肝线粒体超微结构的影响

由图2可见，正常对照组肝细胞胞核多呈圆形，胞浆富含线粒体，线粒体嵴清晰可见(图2A)。模型组大鼠线粒体明显肿胀、线粒体嵴断裂、模糊或消失，可见大量大小不等脂滴，内质网膜肿胀，变性严重;细胞核皱缩(图2B)。CGB 2.4 和0.8 g·kg-1组肝线粒体丰富，内部肿胀较轻，嵴损伤减少，内质网肿胀减轻(图2C，D)。GBE 0.8 g·kg-1组有线粒体肿胀，嵴模糊不清(图2E)，对线粒体的损伤介于CGB组与模型组之间。

2.5 CGB对肝损伤大鼠肝组织 CYP2E1和CYP3A4活性的影响

由图3和表4可见，正常对照和肝损伤模型大鼠分别单次ig氯唑沙宗和氨苯砜后，模型组大鼠氯唑沙宗和氨苯砜各时间点的血药浓度与正常对照组比较呈降低趋势。模型组大鼠AUC0-24，cmax均较正常对照组显著降低(P＜0.05，P＜0.01)。由此提示酒精刺激可使大鼠体内CYP2E1和CYP3A4酶活性升高。

Fig.1 Effect of CGB on liver morphology in alcohol-induced liver injured rats(×100).See Tab.1 for the legend.A:normal control;B:model group;C，D and E:CGB 2.4，0.8 and 0.4 g·kg-1 groups，respectively;F:GBE 0.8 g·kg-1 group;G:Bif 0.15 g·kg-1 group.

Fig.2 Effect of CGB on liver ultrastructure in alcohol-induced liver injured rats.A:normal control group，B:model group，C-D:CGB 2.4 and 0.8 g·kg-1 groups，E:GBE 0.8 g·kg-1 group.

Fig.3 Effect of CGB on blood concentrations of chlorzoxazone(A)and dapsone(DDS)(B)in plasma of rats.Rats in normal control and model gorups were ig given CYP2E1 probe drug chlorzoxazone 50 mg·kg-1 and CYP3A4 probe drugs DDS20 mg·kg-1，respectively，and blood was collected before and after administration 5，10，15，30 min，1，2，3，4，6，8，12，16 and 24 h from the reinal venous，and then rats were ig given CGB 25 mg·kg-1，once a day，for 7 d.Concentrations of chlorzoxazone and DDSwere determined by HPLC.±s，n=8.

Tab.4 Effect of CGB on main pharmacokinetic parameters of chlorzoxazone and DDS

模型组大鼠给CGB后与给药前相比，血浆中氯唑沙宗、氨苯砜各时间点血药浓度呈升高趋势。模型组氯唑沙宗和氨苯砜AUC0-24和cmax给予CGB后均较给予CGB前显著升高(P＜0.05)，且氯唑沙宗t1/2给药后较给药前升高(P＜0.05)。其中模型组氯唑沙宗和氨苯砜AUC0-24分别是给予CGB前的1.68和1.44倍。提示CGB可抑制酒精性肝损伤大鼠体内CYP2E1和CYP3A4酶活性。

正常对照组大鼠给予CGB后与给予CGB前相比，大鼠血浆中氯唑沙宗和氨苯砜各时间点血药浓度呈降低趋势。正常对照组氯唑沙宗、氨苯砜AUC0-24较给予CGB前明显降低(P＜0.05)，分别是给予CGB前的0.61和0.73倍;且氯唑沙宗cmax给予CGB后较给予CGB前显著降低(P＜0.05)。提示CGB可诱导正常大鼠体内CYP2E1和CYP3A4酶活性。

3 讨论

本研究采用ig给予白酒-玉米油混合制备慢性酒精性肝损伤模型，10周后，模型组大鼠AST和ALT升高、肝细胞肿胀、脂肪变性，线粒体嵴模糊及严重水肿。SOD和GSH水平明显下降，MDA含量显著升高。这与文献报道的乙醇经肝代谢产生大量自由基，发生氧化应激和生物膜脂质过氧化而损伤肝细胞结果［9］相一致。CGB 2.4 和 0.8 g·kg-1组可明显降低血清ALT和AST水平，升高肝匀浆GSH和SOD水平、MDA水平下降，减轻肝细胞肿胀、脂肪变性及线粒体损伤程度。提示CGB可提高肝清除自由基的能力，减轻乙醇所致的脂质过氧化损伤。

有报道认为，在酒精性肝损伤状态下，CYP2E1和CYP3A4活性的上调可致大量自由基产生，加重膜脂质过氧化，损伤肝［10-11］。CYP2E1和 CYP3A4是主要在肝表达的药物代谢酶的重要亚型，正常情况下，可以促进外源性药物与毒物的代谢，在代谢和解毒以及维持机体生理功能和内环境稳定具有重要作用［12］;氯唑沙宗主要经CYP2E1酶代谢，氨苯砜主要经CYP3A4酶代谢，上述两种药物常作为酶的探针药，而用于考察药物对CYP2E1和CYP3A4酶活性的作用。本实验借助氯唑沙宗和氨苯砜在体内血药浓度的变化来反眏药物对相应酶的影响。乙醇造成肝损伤后，大鼠血浆氯唑沙宗、氨苯砜代谢增强，说明肝损伤过程中CYP2E1和CYP3A4的高诱导参与了氧化损伤过程。模型组大鼠给予CGB后，氯唑沙宗和氨苯砜AUC0-24，cmax均较给药前显著升高，其中 AUC0-24分别是给予 CGB前的1.68和1.44 倍(在弱抑制剂的 1.25 ～2 倍范围内［7］)。可见，CGB可抑制模型组大鼠血浆 CYP2E1和CYP3A4酶活性的升高，从而减轻肝氧化应激性损伤。

此外，研究发现正常组大鼠给予CGB后，氯唑沙宗、氨苯砜的AUC0-24较给药前明显降低，分别是给药前的0.61，0.73倍，说明 CGB对正常大鼠CYP2E1和CYP3A4酶有诱导效应，提示CGB与某些经肝药酶代谢的药物合用时，可以加速该类药物的代谢。

研究结果提示，CGB具有防护乙醇所致的大鼠肝脏损伤作用，其机制与氧化应激干预密切相关。是否刺梨中的SOD、维生素C与银杏叶提取物中的黄酮醇苷可产生协同抗氧化，值得进一步探讨。

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