多重耐药鲍曼不动杆菌耐消毒剂、灭菌剂基因研究

侯明玖(江陵县人民医院检验科，湖北 江陵 434100)

曾 明(湖北省临床检验中心，湖北 武汉 430064)

侯玲俐，杨宏伟(湖北医药学院附属太和医院，湖北 十堰 442000)

多重耐药鲍曼不动杆菌耐消毒剂、灭菌剂基因研究

侯明玖(江陵县人民医院检验科，湖北 江陵 434100)

曾 明(湖北省临床检验中心，湖北 武汉 430064)

侯玲俐，杨宏伟(湖北医药学院附属太和医院，湖北 十堰 442000)

目的：了解多重耐药鲍曼不动杆菌菌株的消毒剂与磺胺类抗菌药物耐药相关基因存在状况，揭示鲍曼不动杆菌的耐药机制。方法：琼脂稀释法测定医院常用消毒剂的MIC，并用PCR法检测I类整合子标志物之一的qacE△1-sul1 同时也是消毒剂耐药基因。结果： 20株多重耐药鲍曼不动杆菌对医院常用消毒剂苯扎溴铵(新洁尔灭)和二氯异氰尿酸钠(洁消精)的MIC分别为8～32μg /ml之间，高于对照菌的MIC； qacE△1-sul1基因阳性率100%。结论： 多重耐药鲍曼不动杆菌对医院常用消毒剂苯扎溴铵和二氯异氰尿酸钠表现为耐药；I类整合子标志物之一的消毒剂与磺胺类等抗菌药物耐药相关基因(qacE△1-sul1) 携带率较高，与消毒剂与复方新诺明耐药表现一致，说明细菌携带qacE△1-sul1基因是消毒剂、灭菌剂耐药的主要因素。

鲍曼不动杆菌；多重耐药；耐药机制

多重耐药鲍曼不动杆菌(multi-drug resistant Acinetobacter baumannii, MDRAB)是重要的医院内感染病原菌之一，可引起院内感染的暴发流行。在医院感染控制中消毒剂起着重要的作用[1]，目前各种消毒剂在医院应用十分广泛，与其它抗生素一样，细菌对医院常用消毒剂的耐药也越来越广泛。国内外不同地区的学者近年来已从MDRAB中均检测出携带耐消毒剂基因的菌株[2-3]。我们对多重耐药鲍曼不动杆菌20株对医院常用消毒剂苯扎溴铵(新洁尔灭)和二氯异氰尿酸钠(洁消精)的耐药性及其相关基因(qacE△1-sul1)进行了初步研究。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1 菌株来源 2009年度从太和医院住院患者的痰、尿液、伤口分泌物等标本中分离出的20株多重耐药鲍曼不动杆菌，经VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定药敏系统鉴定，并作基因检测。质控菌株：铜绿假单胞菌ATCC27853。

1.1.2 仪器 VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定药敏系统(法国梅里埃公司)，PE700型DNA扩增仪(美国PE公司)，G-BOX ND200凝胶成像仪(美国基因公司)。

1.2方法

1.2.1 抗菌药物原液配制 称取抗菌药物(抗菌药物苯扎溴铵(新洁尔灭)和二氯异氰尿酸钠(洁消精)干粉，按药典推荐的溶解剂溶解，将药物分别配制成5120μmol/L的抗菌药物原液，经过过滤后，在-20℃冰箱冷藏。根据以下公式计算药物干粉用量[4]：

质量(mg)=溶剂(ml)×浓度(mg/ml)/分析效能

1.2.2 含药M-H琼脂平板制备 药物原液，用双蒸水稀释，使药物的终浓度(μg/ml)分别为5120、2560、1280、640、320、160、80、40、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3。称取M-H干粉38g加入蒸馏水920ml，溶解后，将pH调整至7.4，在121℃下灭菌15min，冷却至50℃左右，用量筒量取22.5ml溶液倾注于直径为9cm的无菌培养皿，快速加入相相应的抗菌药物稀释液2.5ml，对照平板则加入2.5 ml无菌蒸馏水，就配成含不同浓度药物的M-H平板，自然冷却，无菌试验合格后置2～8℃冰箱冷藏备用[5]。

1.2.3 显色药敏 (MIC)测定 采用琼脂稀释法测定苯扎溴铵(新洁尔灭)和二氯异氰尿酸钠(洁消精)的MIC。琼脂稀释法严格按美国临床实验室标准化研究所(CLSI)2008版[5]操作。挑取培养好的单个菌落，用生理盐水配成0.5麦氏浊度的细菌悬液，将细菌悬液与生理盐水再稀释10倍，吸取菌液约1～2μl接种于含药M-H琼脂平板表面，同时接种生长对照平板。35℃温箱孵育24h后判断结果。判断界值标准参照CLSI M100-S18[5]进行。

1.2.4 耐药基因检测 根据GenBank公布的耐药基因序列，用Primer Premier 5.0软件自行设计引物，qacE△1-sul1引物：P1：5′-TAGCGAGGGCTTTACTAAGC；P2：5′-ATTCAGAATGCCGAACACCG。其扩增后产物长度300bp。细菌DNA提取：双蒸水法，挑取细菌加入含250μl无菌双蒸水的EP管，沸水浴5min，离心(13000rpm)10min，取上清即为细菌DNA。

基因扩增：PCR法，反应体系：Taq酶(5U/μl) 0.2μl，MgCl22μl，dNTP 1.25μl，10×Buffer 2.5μl，引物各1μl，标本1μl，ddH2O14.8μl，SYBR 1.25μl，反应总体积为25μl。反应条件：94℃预变性2min(1个循环)， 94℃30s、55℃30s 、72℃45s(30个循环)， 72℃7min(1个循环)。

基因检测：2%琼脂糖凝胶电泳，PCR扩增产物加入凝胶的点样孔，以 DNA Marker作对照；电压60V，4.5h电泳。电流后在凝胶成像分析仪上成像(以ATCC25922及空白为阴性对照)。

2 结 果

2.1显色药敏结果

20株多重耐药不动杆菌测定的苯扎溴铵(新洁尔灭)和二氯异氰尿酸钠(洁消精)MIC结果见表1。

表1 苯扎溴铵和二氯异氰尿酸钠的MIC结果及基因检测结果

图1 qacE△1-sul1基因PCR产物电泳图

2.2基因检测结果

PCR 产物电泳图见图1 。20株多重耐药不动杆菌耐消毒剂基因(qacE△1-sul1) 阳性率为100%。

3 讨 论

目前鲍曼不动杆菌已经成为各级医院最难以治疗和控制的医院感染病原菌之一。在医院感染控制过程中消毒剂应用十分广泛，医院感染的各种细菌在低剂量或亚致死剂量消毒剂的作用下，受到选择压力的作用，产生耐药性。因此细菌对各种消毒剂的耐药现象已经成为医院感染控制研究的新的领域。国内外已发现多种菌株对消毒剂产生了耐药性，例如对双胍类、酚类、季铵盐类、醇类、碘等的耐药性[6-7]。作者对20株多重耐药鲍曼不动杆菌菌株对目前医院常用和消毒剂苯扎溴铵和二氯异氰尿酸钠进行了MIC测定，其MIC均在8～32μg/ml，均高于标准株的4μg/ml和1μg/ml的水平，研究结果提示对MDRAB医院常用消毒剂苯扎溴铵(新洁尔灭)和二氯异氰尿酸钠(洁消精)耐药。细菌携带qacE△1-sul1基因是其对医院常用消毒剂耐药的主要因素，其中qac基因所编码的Qac蛋白是膜蛋白型的多药转运蛋白，其可介导对亲脂性消毒剂(Quatemary Ammonium Compounds，Qac)外排。如果细菌获得这一基因并开始表达则细菌将双胍类(如氯已定)、季胺类(如苯扎溴铵) 、碱性染料、腙类化合物等排出细菌体外。目前已发现的qac基因家族有A、B、C、D、E、E△1、F、G、H、J等10种，其中由整合子介导的qacE△1基因，广泛的存在于革兰阳性菌和阴性菌[8-10]。sull基因可编码二氢叶酸合成酶，这一基因阳性则提示细菌对磺胺类药物耐药。qacE△l基因和sull基因为重叠基因，存在于I类整合子的3′保守端。本文作者在qacE△1下游和sul1上游分别设计引物P1、P2，基因扩增阳性则表示qacE△l和sul1基因同时存在。I类整合子在整合子介导的细菌耐药机制中起着十分重要的作用，目前用来检测I类整合子最常用且最有效的方法就是用PCR扩增方法检测Ⅰ类整合子的intI1 和(或) qacE△1标志物。我们用PCR法检测消毒剂耐药相关基因(qacE△1-sul1)，检测结果发现20株多重耐药的鲍曼不动杆菌的相关基因的阳性率为100%。

本实验结果提示本地区多重耐药鲍曼不动杆菌对目前临床常用的消毒剂的MIC值均不同程度高于标准菌株，细菌的耐药基因检测均为阳性，说明本地区的MDRAB菌株对消毒剂产生了耐药趋势，因此医院感染控制部门应对这一现象引起高度关注。这一结果还提示医院相关部门和广大医务工作者需要高度重视在医院内规范使用消毒剂的的问题，同时加强医院各项消毒管理制度，提高医护人员对手卫生的重视，防止消毒剂耐药的菌株的在医院内的传播，从而减少医院感染的发生。

[1]林辉，郑剑.铜绿假胞菌对消毒剂抗药性的研究进展[J].中国消毒学杂志，2007，24(3)：269-271.

[2]黄支密，糜祖煌，石晓霞，等.医院感染革兰阴性杆菌耐消毒剂基因研究[J].中华医院感染学杂志，2005，15(7)：721-724.

[3]Kaxama H，Hamashima H，Sasatsc M，et al.Distribution of the antiseptic-resistance genes qacE and qacE deta 1 in gram-negative bactria[J].FEMS Miroobiol Lett，1998，159(2)：173-178.

[4]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].二部.北京：化学工业出版社，2000.

[5]Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Performance standards for antimicrobial susceptibility testing[S]. 18ed. Approved standard M2-A9 (M100-S18). CLSI，2008：116-118.

[6]Jain R，Danziger L H.Multidrng-resistant Acinetobacter infections：an emerging Challenge to clinicians[J].Ann Pharmacother，2004，38(9)：1449-1459.

[7]王震宇.细菌对消毒剂抗性研究进展[J].中国消毒学杂志，2007，24(2)：169-173.

[8]Mitchell B A，Brown M H，Skurray R A.QacA multidrug emux pump from staphylococcus：comparative analysis of resistance to diamidines，biguanines，and guanylhydragones[J].Antimicrob Agents Chemother，1998，42(2)：475-477.

[9]Mayer S，Boos M，Beyer A，et al.Distribution ofthe antiseptic resistance genes qacA，qacB and qacC in 497 methicillin-resistant and susceptible European isolates of Staphylococcus aureu[J].J Antimicrob Chemother，2001，47(6)：986-997.

[10]Ploy M，Courvalin P，Lambert T.Characterization of Entembacter aerogenes BM2688.a class l integron with two new gene cassettes，cmlA2 and qacF[J].Antimicmb Agents Chemotber，1998，42(10)：2557-2563.

[编辑] 一 凡

R446.5

A

1673-1409(2012)04-R062-03

10.3969/j.issn.1673-1409(R).2012.04.031

2012-03-02

湖北省十堰市科技攻关项目(2009S25)

侯明玖(1972-)，男，湖北荆州人，主管技师，主要从事临床检验工作；通讯作者：侯玲俐，E-mail：472230556@qq.com。