补肾化痰方对去卵巢大鼠骨髓细胞Cbfαl、BGP mRNA表达的影响

胡 娅(长江大学医学院，湖北 荆州 434023；湖北中医药大学临床医学院，湖北 武汉 430061)

蹇顺华，向 楠(湖北中医药大学临床医学院，湖北 武汉 430061)

补肾化痰方对去卵巢大鼠骨髓细胞Cbfαl、BGP mRNA表达的影响

胡 娅(长江大学医学院，湖北 荆州 434023；湖北中医药大学临床医学院，湖北 武汉 430061)

蹇顺华，向 楠(湖北中医药大学临床医学院，湖北 武汉 430061)

目的：观察补肾化痰方对去卵巢(OVX)骨质疏松症大鼠骨髓细胞中核结合因子αl(Cbfαl)和骨钙素(BGP)mRNA表达的影响。方法：SD大鼠行双侧卵巢切除术，术后3月以补肾化痰方灌胃给药，连续8周；处死大鼠，逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测大鼠骨髓细胞Cbfαl和BGP mRNA的表达。结果：补肾化痰方中、高剂量组Cbfαl mRNA和 BGP mRNA表达水平均明显高于模型组，差异有统计学意义(Plt;0.01)。结论：补肾化痰方通过上调Cbfα1和BGP的基因表达，促进成骨细胞分化，对去卵巢大鼠骨质疏松症有较好的治疗作用。

补肾化痰方；骨质疏松症；核结合因子αl(Cbfαl)；骨钙素(BGP)

骨质疏松症(Osteoporosis，OP)是一种由多种原因引起的全身性骨骼疾病,它以骨组织显微结构退化，骨量减少为主要特征,导致骨的脆性增加而容易发生骨折[1]。临床上主要表现为腰背肢体疼痛, 病理骨折，身体畸形,或伴有原发疾病表现。本病属于中老年人的一种退行性病变，发病率高，严重危害中老年健康，已成为老龄化社会卫生保健突出问题。本实验通过检测去卵巢骨质疏松症大鼠骨髓细胞Cbfαl mRNA和 BGP mRNA表达的变化，探究补肾化痰方调节骨代谢的机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1 药品 补肾化痰方由菟丝子30g、淫羊藿10g、补骨脂15g、全瓜蒌15g、红曲12g和生山楂20g组成，生药由湖北中医药大学附属医院门诊部中药房提供，加水煎煮，过滤，并浓缩，配制成0.94g/ml和1.88g/ml两个浓度的生药混悬液，密封贮存于4℃冰箱备用。利维爱(南京欧加农制药有限公司，2.5 mg/片，批号：LK-4305-10)。

1.1.2 试剂 TRIzol Reagent(美国invitrogen公司)，逆转录试剂盒(美国invitrogen公司)，Taq DNA聚合酶(大连宝生物工程有限公司)，PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司设计合成。

1.1.3 实验动物 8月龄雌性SD大鼠，清洁级，由华中科技大学同济医学院提供，许可证号SCXK(鄂)2004-0007。

1.1.4 仪器 Biometra PCR扩增仪(德国), DYY-6C琼脂糖凝胶电泳设备(北京六一仪器厂)，超净工作台(苏州净化设备厂)，WD-9403C紫外透射仪(北京六一仪器厂)，labofuge400R离心机(Thermo公司)。

1.2方法

1.2.1 去卵巢大鼠模型的建立和分组 大鼠随机分为对照组、假手术组、西药组、中药中剂量组、中药高剂量组。除对照组外，其他各组大鼠均行卵巢切除术。麻醉后，无菌条件下行背部肋下双侧卵巢切除。假手术组术式相同，但不摘除卵巢，仅切除少量卵巢周围脂肪组织。手术3个月后开始灌胃给药，中药组以补肾化痰方按体质量灌胃，中剂量组9.4g/kg，高剂量组18.8g/kg；西药组则予以利维爱0.23 mg/kg，对照组、假手术组予以等体积的生理盐水，1次/d，给药时间为8周。期间各组大鼠分笼常规饲养，自由饮水摄食。

1.2.2 骨髓细胞Cbfαl mRNA、BGP mRNA表达的测定 无菌状态下取出大鼠的左侧股骨，去除附着的肌肉及软组织后，剪短两端骨垢端，刮取骨髓腔内骨髓组织，采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测BGPmRNA、CbfαlmRNA表达。 Trizol法提取细胞总mRNA，逆转录合成cDNA，进行PCR反应。Cbfαl引物序列：上游引物5′-CTACTCTGCCGAGCTACGAAAT-3′，下游引物5′- TCTGTCTGTGCCTTCTTGGTTC-3′。BGP引物序列：上游引物5′-AGCAGGAGGGCAGTAAGGT-3′，下游引物5′- TGTGCCGTCCATACTTTCG-3′。β-actin序列：上游引物5′-CGTTGACATCCGTAAAGACCTC-3′，下游引物5′-TAGGAGCCAGGGCAGTAATCT-3′。扩增条件：94℃变性30 s，58℃退火30s，72℃延伸1 min，35个循环后，72℃终末延伸5min，降至4℃取出。扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，应用图像分析仪对扩增条带的光密度进行测定，并计算该基因与β-actin基因的光密度比值。

1.3统计学分析

2 结 果

与假手术组相比，模型组的CbfalmRNA表达水平明显下降(Plt;0.01)；中药高剂量组、中药中剂量组以及西药治疗组在用药2个月后，可明显上调BGPmRNA和CbfαlmRNA的表达水平，与模型组相比较，Plt;0.01。

表1 各组大鼠骨髓细胞BGP mRNA、Cbfαl mRNA的表达

注：与模型组相比，**Plt;0.01；与假手术组比较，ΔPlt;0.05，ΔΔPlt;0.01。

图1 大鼠骨髓细胞Cbfαl mRNA RT-PCR产物电泳图

图2 大鼠骨髓细胞BGP mRNA RT-PCR产物电泳图

3 讨 论

骨质疏松的直接原因是骨形成和骨吸收所组成的骨重建过程的失衡，而骨的形成主要由成骨细胞完成。成骨细胞是骨发生和骨形成的物质基础，在骨不断的更新活动中是最重要的功能细胞，Cbfαl是成骨细胞的特异性转录因子，对于成骨细胞分化具有重要意义，Cbfαl可以诱导其下游的一系列成骨相关基因(如骨钙蛋白、Ⅰ型胶原蛋白、骨桥蛋白等)的表达，研究证实它是控制骨形成的关键因子[2-3]，敲除此基因可导致成骨细胞发育被抑制及显著的骨发育不良或者不发育。Cbfα1的表达受多种因子的影响,其中BMPs是调节Cbfα1表达的一类重要生长因子, 我们前期实验结果显示补肾化痰方能增强OVX大鼠BMP-2表达[4]，推测补肾化痰方可能是通过上调BMP-2，进而促进Cbfαl表达,并启动Cbfα1下游的一系列成骨相关基因的表达,从而促进成骨细胞的分化、增殖及骨的发育、生成。

成骨细胞能分泌多种因子及蛋白，其中骨钙素是成骨细胞分化成熟的特异性指标之一，为最主要的评价成骨细胞活性的指标。骨钙素(bone glaprotein，BGP)也称骨γ-羧基谷氨酸蛋白，是由成熟的成骨细胞合成的一种非胶原蛋白，BGP的主要生理功能是维持骨正常钙化速率,抑制异常羟磷灰石结晶形成，抑制软骨矿化速率，可直接反映成骨细胞的活性和骨生理代谢变化[5-6]。本实验中模型组OVX大鼠骨髓细胞BGP mRNA表达水平明显低于假手术组(Plt;0.01)，也反映出模型组大鼠的成骨细胞活性下降。而补肾化痰方组BGP mRNA表达明显高于模型组(Plt;0.01)，提示补肾化痰方能够刺激成骨细胞活性，使骨形成活动增强。

骨质疏松症属于中医“骨痿”、“骨痹”、“腰痛”、“骨枯”、“骨极”的范畴。补肾法历来被作为治疗肾虚骨质疏松症的主要疗法, 研究证实补肾中药能促进骨形成[7]，使OVX骨质疏松模型大鼠产生较多的骨基质, 使类骨质转变为矿化骨小梁，但究竟如何促进骨形成尚需深入研究。本实验提示补肾化痰方可通过上调Cbfα1的基因表达，并启动其下游的一系列成骨相关基因如BGP的表达，促进成骨细胞分化，从而调节骨重建过程中骨形成的主导方向，改善骨质疏松病理状态。

[1]刘忠厚，杨定焯，朱汉民，等.中国人原发性骨质疏松症诊断标准[J].中国骨质疏松杂志，1995，5(1)：1-3.

[2]Ducy P, Zhang R, Geoffroy V, et al. Osf2/Cbfa1:a transcriptional activator of osteoblast differentiation[J]. Cell，1997，89(5)：747-754.

[3]Komori T, Yagi H, Nomura S，et al. Targeted disruption of Cbfαl results in a complete lack of bone formation owing to maturational arrest of osteoblasts[J]. Cell, 1997，89(5): 755-764.

[4]胡娅，蹇顺华，向楠，等.补肾化痰方对去卵巢大鼠骨组织中BMP-2和TGF-β1表达的影响[J].山西中医学院学报，2012，13(1)：16-17.

[5]冼华，曹文富.补骨防疏煎剂对骨质疏松症大鼠血清骨钙素的影响[J].中国药房，2011，22(19)：1751-1753.

[6]薛荫昌，贾玉巧，许秀辉，等.大鼠骨质疏松模型中骨碱性磷酸酶、白细胞介素-6及骨钙素的表达[J]. 职业与健康，2010，26(6)：608-610.

[7]潘伟军，曾昭明，黄宏兴.补肾益精法治疗更年期妇女骨质疏松的临床观察[J].山西中医学院学报，2006，7(4)：30-31.

[编辑] 一 凡

R681.1；R242

A

1673-1409(2012)04-R001-03

10.3969/j.issn.1673-1409(R).2012.04.001

2012-03-28

教育部高等学校博士学科点基金项目(200805070003)。

胡娅 (1978-)，女，湖北荆州人，讲师，博士，主要从事中药基础与临床药理研究；通讯作者：向楠，E-mail：xiangnan61@sina.com。