电除颤术后窦房结缝隙连接蛋白40的表达

张燕翔 (武汉大学医学院法医学教研室，湖北 武汉 430071；长江大学医学院病理学教研室，湖北 荆州 434023)

孟祥志，汪 浩，王 春 (武汉大学医学院法医学教研室，湖北 武汉 430071)

电除颤术后窦房结缝隙连接蛋白40的表达

张燕翔 (武汉大学医学院法医学教研室，湖北 武汉 430071；长江大学医学院病理学教研室，湖北 荆州 434023)

孟祥志，汪 浩，王 春 (武汉大学医学院法医学教研室，湖北 武汉 430071)

目的：探讨人工心肺复苏电除颤术后缝隙连接蛋白40(Connexin40, Cx40)在窦房结(SAN)中的表达。方法：从2008年至2010年成人尸体解剖案例中，筛选出20例，将其中心肺复苏过程中接受过电除颤者设为A组(n=7)；仅施行标准人工心肺复苏术而未接受电除颤者设为B组(n=8)；另选取5例正常窦房结组织设为对照组(C组,n=5)。窦房结取材，常规制片，分别行MASSON染色及免疫组化Cx40染色，用图像分析系统分析每高倍视野窦房结间质比例及窦房结中Cx40表达的IOD值， 统计软件对所得数据进行分析。结果：A组窦房结间质比例与B组比较、A组与C组比较，差异均有统计学意义(Plt;0.05)；B组与C组比较，差异无统计学意义(Pgt;0.05)；A组SAN中 Cx40表达IOD值与B组比较、A组与C组比较，差异均有统计学意义(Plt;0.05)；B组与C组比较，差异无统计学意义(Pgt;0.05)。结论：电除颤术后SAN间质胶原纤维和弹力纤维网状结构松散，部分断裂，水肿，SAN的自我保护功能部分受损；SAN中Cx40表达降低，GJ通道功能受损。

缝隙连接蛋白40；窦房结；法医病理学；心肺复苏；电除颤术

人工心肺复苏(cardiopulmonary resuscitation，CPR)和电除颤术(electrical defibrillation，ED)广泛应用于临床急救，然而，在施行过程中亦可对人体造成多种损伤。法医实践中，常见肋骨骨折、胸骨骨折等。近年文献中，CPR及ED对心脏的损伤研究大多局限于心肌[1-2]，而一定强度电流造成心传导系统损伤的报道则见于电击死的研究中[3]。CPR和电除颤术造成人体传导系统损伤少见报道[4-5]。窦房结(sinoatrial node, SAN)是传导系统的重要组成部分，在心电产生和传导方面起作用。其心电的产生和传导需要依赖功能细胞之间的电偶联来实现，缝隙连接通道(Gap junction, GJ)是实现功能细胞间电偶联的结构基础[6-7]。我们通过观察人体接受CPR及ED术后SAN组织细胞形态及组织结构的变化，并通过SAN缝隙连接蛋白40(Connexin40，Cx40)的表达差异，初步探讨CPR及ED对人体SAN功能的影响。

1 材料与方法

1.1主要实验材料

多克隆兔抗人connexin 40 Ⅰ抗(北京中杉公司)，PV9000免疫组化试剂盒(福州迈新公司)，MASSON三色染色试剂盒(珠海贝索公司)，显微照相系统(Leica LB-2型，德国)，Image-pro Plus6.0图像分析系统(Media Cybernetics, USA)。

1.2方法

1.2.1分组 本组资料来源于2008年至2010年武汉大学医学院法医司法鉴定所成人尸体解剖133案例，筛选出其中20例，均符合如下标准：①档案完整，资料齐全，保存有全部的治疗抢救记录。②均于死后24h内进行系统尸体解剖，后经法医病理学诊断死因明确。③死亡前均无心传导系统疾病及损伤史，亦无胸部外伤史。④死亡前均接受过心肺复苏。将其中7例心肺复苏过程中接受过电除颤者设为实验组(A组)；仅施行心肺复苏术而未接受电除颤者8例设为B组；选取5例未接受过心肺复苏抢救，经法医病理学检查证实生前无心脏及传导系统疾病者设为对照组(C组)。

1.2.2取材、制片及染色 采用宋一璇[8]改良的心脏传导系统解剖法，获取死者心脏窦房结样本，10%中性甲醛固定，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片(4～6μm)分别作HE染色、MASSON三色特殊染色、免疫组织化学染色。MASSON三色特殊染色前切片脱蜡至水，后浸入Bouin氏固定液37°温箱处理2h，水洗后再行染色，具体步骤参照试剂盒附带说明书，甲苯胺蓝复染，中性树胶封固；免疫组织化学具体步骤参照说明书，每例均以PBS液代替Cx40一抗作为阴性对照，以试剂盒附送的阳性片作为阳性对照，DAB显色，苏木素复染，中性树胶封固。

1.2.3图像分析 MASSON三色特殊染色切片利用Image-pro Plus6.0图像分析系统，高倍镜下随机选取5个视野(×400)，统计每高倍视野窦房结间质所占比例，每高倍视野窦房结间质比例(%)=(每高倍视野窦房结间质面积/每高倍视野窦房结组织面积)×100%。

免疫组化切片均随机选择5个视野，在高倍视野下(×400)利用Image-pro Plus6.0图像分析系统，进行各组窦房结Cx40表达的半定量分析，测定积分光密度值 (Integrated Optical Density，IOD)，比较Cx40含量变化情况。

1.3统计学分析

2 结 果

2.1一般形态观察结果

人SAN镜下HE染色较淡，能明显与周围心房肌区别开。A组起搏细胞(P细胞)边界不清，肿胀明显，胞核染色加深或核内空亮，染色质边集，胞浆嗜碱性，部分P细胞见散在的细胞核固缩，移形细胞(T细胞)亦肿胀，横纹模糊，辨识不清，局部可见零星立方形T细胞，SAN间质疏松化，间质水肿，毛细血管明显扩张充血，但各例肉眼及镜下均未见出血。B组与C组镜下变化差异并不明显，P细胞、T细胞显露清楚，P细胞小而短，横切呈短棒状或卵圆形，胞质淡染，间质亦有轻度水肿，毛细血管扩张充血；T细胞大多位于周边区，体积比P细胞大，细胞形态狭长，核呈长梭形。3组镜下SAN实质间质成分相互混杂，界限不清，HE染色下无法清晰比较P细胞、T细胞及结缔组织结构和细胞数目的变化。

2.2MASSON染色结果

SAN采用Mssson三色染色结果细胞核为蓝色，细胞质、肌纤维和红细胞呈红色，胶原纤维呈蓝色，实质间质辨析清楚，P细胞、T细胞和结缔组织区别明显，肌纤维横纹显示良好。A组胶原纤维和弹力纤维网状结构局部连续性中断，毛细血管扩张，未见出血改变(见图1)。窦房结间质比例较B组、C组明显降低，差异有统计学意义(Plt;0.05)，B组与C组相比较，差异无统计学意义(Pgt;0.05)(见表1)。

(a) A组窦房结间质胶原纤维和弹力纤维网状结构局部连续性中断，毛细血管扩张；(b)实质间质辨析清楚，P细胞、T细胞和结缔组织区别明显，肌纤维横纹显示良好；(c)正常对照组。

2.3免疫组化Cx40表达结果

表1 各组窦房结高倍镜下间质比例和Cx40表达IOD值比较

尸检所得人体心脏SAN 中棕黄色Cx40免疫阳性颗粒呈团块状聚集, 分布不均，细胞膜上或弥散入胞浆表达,多聚集于细胞的侧侧或端端连接处, Cx40在心肌的表达较SAN内多。在SAN内，Cx40在P细胞、T细胞表达稀疏，多分布于中心区结动脉周围，SAN周边部分布极少，但在SAN的传导纤维内表达明显(见图2)。A组SAN Cx40表达IOD值较B组、C组明显降低，差异有统计学意义(Plt;0.05)，B组与C组相比较，差异无统计学意义(Pgt;0.05)(见表1)。

(a) Cx40 免疫阳性颗粒呈团块状聚集, 分布不均，细胞膜上或弥散入胞浆表达,多聚集于细胞的侧侧或端端连接处,A组表达降低；(b)B组Cx40窦房结中阳性表达与C组差异并不显著；(c)正常对照组。

3 讨 论

当心搏骤停发生时，迅速而有效的采取CPR，能提高抢救的成功率，心搏骤停患者大约有80%～90%第一个捕获的心电图是室颤, 因而尽早实施ED是治疗室颤的有效手段,除颤越早, 成功率越高[9-10]。除颤器产生强度可控的脉冲电流作用于心脏, 瞬间电流强度可达360J或者更高，强迫所有心肌细胞在瞬间几乎全部处于除极状态，造成瞬间停搏，这样就有可能让自律性最高的窦房结重新起搏心脏，控制心搏转复为窦性心律[11]。但在抢救患者生命的同时，可能产生有害效应，包括细胞膜断裂、电击后阻滞、机械性功能不良和新的快速心律失常[12]。

在法医实践中，电击死者SAN的组织病理学观察其形态变化包括点、片状出血，P细胞、T细胞浊肿、传导纤维浊肿，严重时甚至可见液化性坏死等表现[13]。我们观察常规HE染色镜下A组表现与其大致相符，但均未见心内膜下出血及液化性坏死等现象，B组和C组镜下观察无异常；提示在施行电除颤术后，可能造成窦房结损伤。而镜下未能观察到如电击死者所具有的心内膜下出血及液化性坏死等现象的原因，考虑为医用除颤器电流强度虽然瞬间可达到360焦耳甚至更高，但刺激时间较短，其伤害程度较电击轻。

在心传导系统以及SAN的研究中，间质变化特点一直是不容忽视的要点之一。MASSON三色染色法能够清晰显示SAN胶原纤维和弹力纤维网状结构支架，使得主质与间质对比清楚；同时，MASSON三色染色法能更好将SAN中P与T细胞区别开，使功能心肌细胞横纹显示更加清楚。本实验结果表明，在光学显微镜下观察人体SAN形态，MASSON染色显然较传统的HE染色更加适合。本实验同时发现，A组SAN间质比例较B组、C组明显降低，差异有统计学意义(Plt;0.05)，B组与C组相比较，差异无统计学意义(Pgt;0.05)。这一结果说明，心电除颤电流刺激可造成SAN间质胶原纤维和弹力纤维网状结构松散，局部断裂，间质水肿， SAN的自我保护功能部分受损；而B组以单纯的胸外心脏按压，虽然亦可观察到SAN间质水肿和毛细血管的扩张，但其程度明显较A组为轻。

GJ是相邻心肌细胞膜之间形成的特化区域，在细胞间起代谢耦联和电耦联作用,完成细胞之间的电化学信息交换，是维持电生理搏动的结构基础。GJ由相邻心肌细胞胞膜上的缝隙连接蛋白半通道(connexin hemichannels)对接形成连接小体，每个半通道则由6个缝隙连接蛋白(Connexin, Cx)构成[7]，其通道功能主要受到细胞内Ca2+浓度、pH值变化以及神经激素的调节[14-15]。Kwong等[16]通过对成年犬的研究发现，窦房结中大约有55%细胞只表达Cx40，宋慧芳等[7]针对人体窦房结的实验研究也证明，人体窦房结中缝隙连接蛋白的表达以Cx40为主，其他类型的连接蛋白分布稀少。亦有研究表明，Cx40的表达异常与各种类型的心律失常特别是房颤的持续存在密切相关[17-19]。以上结论说明，SAN电冲动的产生、传导以及心律的维持与Cx40密切相关。本实验观察到，SAN 中棕黄色Cx40 免疫阳性颗粒呈团块状聚集,中心区结动脉周围分布相对较多，而SAN周边部分布少，可能与SAN中心区P细胞产生的心电冲动集中整合，保证结优势起搏点能够集聚充分的起搏冲动后传导有关；Cx40在心肌的表达较SAN内表达多，说明心电冲动在SAN内传导可能较慢，符合SAN能自动发出兴奋但不能很快传导的电生理特性。本实验A组SAN中 Cx40表达IOD值较B组、C组明显降低，其IOD值下降，差异有统计学意义(Plt;0.05)。Cx40在电除颤组中的表达明显减少的可能机制是：心脏遭受除颤电流刺激后，间质胶原纤维和弹力纤维网状结构松散，部分断裂，SAN的自我保护与兴奋传导隔离功能部分受损；同时除颤电流刺激强迫所有心肌细胞在瞬间几乎全部处于除极状态，部分受损SAN细胞细胞膜断裂，GJ通道损伤，电流刺激使通道蛋白活性丧失；此外，电流刺激亦可使细胞膜上的钠钾泵、钙泵运转失灵，局部离子浓度发生变化，进一步影响GJ通道的正常功能；而B组与C组Cx40表达差异并不显著，说明对心肌单纯的机械刺激并未造成通道蛋白的活性丧失。

综上所述，对人体施行人工心肺复苏和电除颤术后SAN间质胶原纤维和弹力纤维网状结构松散，部分断裂，水肿，SAN的自我保护功能部分受损；SAN中Cx40表达降低，GJ通道蛋白活性部分丧失。

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[编辑] 一 凡

10.3969/j.issn.1673-1409(R).2012.01.002

R361

A

1673-1409(2012)01-R004-04

2011 11 27

张燕翔(1975)，男，湖北荆州人，实验师，硕士生，主要从事心血管病理与猝死研究；通讯作者：孟祥志，EMAil：mxz63@hotmAil.Com。