李祥华,高 林,余万桂,黄江荣 (长江大学医学院,湖北 荆州 434023)
张家均 (长江大学附属第一医院 荆州市第一人民医院检验科,湖北 荆州 434000)
许甲凤,杜亚明 (长江大学医学院,湖北 荆州 434023)
粉防己碱对雄黄所致小鼠免疫功能低下的影响
李祥华,高 林,余万桂,黄江荣 (长江大学医学院,湖北 荆州 434023)
张家均 (长江大学附属第一医院 荆州市第一人民医院检验科,湖北 荆州 434000)
许甲凤,杜亚明 (长江大学医学院,湖北 荆州 434023)
目的:探讨雄黄中毒所致小鼠免疫功能低下后粉防己碱(Tet)的调节作用。方法:取小鼠随机分为正常对照组,模型对照组,粉防己碱(tetrandrine,Tet)高、中、低剂量组,二巯基丙磺酸钠(DMPS)组。正常对照组给予生理盐水,模型组灌胃给予70mg/kg雄黄混液,Tet高、中、低剂量组分别腹腔注射给予Tet 98.0、49.0、24.5mg/kg,连续42d。采用重量法称量小鼠脾脏和胸腺质量,以其质量与体质量之比作为胸腺和脾脏指数。Giemsa染色计数腹腔巨噬细胞(PMΦ)并计算吞噬百分率和吞噬指数。用比色法测定红细胞(RBC)裂解释放的空斑形成细胞(PFC)量。观察Giemsa染色后淋巴细胞个数并计算母细胞转化率。结果:Tet能增加小鼠脾脏和胸腺的重量,增强小鼠PMΦ的吞噬能力(Plt;0.01),提高小鼠溶血值,增加PFC数(Plt;0.01),能提高小鼠淋巴细胞转化率(Plt;0.01),且有一定剂量差异。结论:对于雄黄所致的小鼠免疫功能低下,Tet的免疫增强作用可能是能使胸腺和脾脏重量增加,PMΦ的吞噬能力增强,淋巴细胞的转化率升高及抗体能力加强等作用有关。
粉防己碱;雄黄;免疫调节剂
近年来,随着人们对雄黄及雄黄复方的深入研究和广泛的临床应用,雄黄受到广泛关注。但临床常有雄黄中毒甚至死亡的报道。雄黄中毒的反应是多方面的,其表现为:影响蛋白质酶的活性,损害神经,影响脂质过氧化物代谢,损伤组织器官,影响免疫功能,引起免疫力下降。此外,损害细胞染色体,阻止细胞正常分裂,麻痹血管平滑肌。前人有用粉防己治疗其中毒,解除其毒性的报道。前期的研究作用表明,粉防己碱(Tetrandrine,Tet)对雄黄中毒动物有促进砷排泄作用[1]。作者以Tet作为解毒剂,对其免疫增强作用进行了探讨,现报道如下。
1.1材料
1.1.1试验药物 Tet为江西银涛制药有限公司产品。雄黄购自湖北省荆州市中药材公司,经荆州市药品检验所刘以民副主任药师鉴定为产于湖南的雄黄正品。二巯基丙磺酸钠(DMPS)注射液(上海天丰药厂),批号021201。
1.1.2动物 清洁级小鼠,体质量(20±2)g,雌雄各半,华中科技大学同济医学院实验动物中心提供,实验动物许可证号:SYXK(鄂)2004-0028。
1.1.3试剂 Giemsa.染液、淋巴细胞分离液,上海化学试剂厂,批号 070713;PRMI-1640、植物血凝素(PHA),Sigma公司(美国),批号 3305RB560;L-谷氨酰胺,上海东风化学试剂厂,批号0511143;小牛血清,杭州四季青生物工程公司,批号20070506。
1.1.4仪器 ThermoLabsystems Multisken M3 型酶标仪,芬兰;LD4-2A型低速离心机,北京离心机厂;765C型分光光度计,上海分析仪器厂;Leica DMLB2型光学显微镜,德国;PG3022型酶联免疫检测仪,华东电子管厂。
1.2方法
1.2.1实验动物分组与处理 取小鼠,随机分为正常对照组,雄黄(模型)组,模型+Tet高、中、低剂量组,模型+DMPS组,每组20只。
1.2.2给药方法 除正常对照组外,各组每鼠每日上午ig给予雄黄70mg/kg,连续6周,实验期间,普通饲料喂养。中午12时停食不停水,下午18时Tet高、中、低剂量组分别ip给予98.0、49.0、24.5mg/kg的Tet注射液;DMPS组ip 7mg/kg的DMPS注射液。给药6d后停药1d为1个周期,连续6个周期。正常对照组给予同样量的生理盐水同法处理。
1.2.3小鼠免疫器官指数的测算 于给药的最后一天,颈椎脱臼处死动物,剖腹,立即取脾脏、胸腺称重,按文献[2]方法计算每组动物器官指数。
1.2.4小鼠PMΦ吞噬功能的测定 于给药的最后一天,按文献[2]方法每鼠ip 10%蛋白胨0.2ml,32h后ip新鲜鸡RBC 0.5ml,30min后处死动物,立即剖腹,洗出腹腔液,37℃温育15min 后离心,取细胞悬液涂片,甲醇固定,Giemsa染色后在油镜下计数200个MΦ。以MΦ吞噬鸡 RBC 的吞噬百分数和吞噬指数为指标表示药物对小鼠PMΦ吞噬功能的影响。
1.2.5小鼠空斑形成细胞(PFC)量的测定 于给药的最后一天, 按方法[3]每鼠ip 5% SRBC 0.2ml,4d 后放血致死,取脾脏,制成脾细胞悬液 ( 约5×106个/ml )。取该悬液0.5ml,加入0.2% SRBC和1∶10 小鼠血清各0.5ml,混匀。另设不加补体作为空白对照,37℃ 温育1h 后离心,取上清液比色(波长r=413nm),测定 RBC裂解释放的PFC量 ( 以D143值表示 )。
1.2.6小鼠淋巴细胞转化率的测算 于停药后的次日,小鼠眼球取血,肝素抗凝。参考文献[3]方法,取血0.1ml加入1.8ml灭菌的PRMI-1640(内含20%小牛血清,30.0g/L谷氨酰胺1.0ml),再加入PHA 0.1ml,37℃温育3d后吸出血清,加8.5g/L NH4Cl 4ml,混匀后37℃水浴10min,离心。取沉淀物滴加于玻片上,Giemsa染色液染色,油镜下观察200个淋巴细胞,计算其母细胞转化率。
1.3统计学分析
2.1Tet对小鼠免疫器官指数的影响
实验结果显示,试药三个剂量组均可增加脾脏和胸腺指数,与正常对照组比较,高、中剂量组局均有非常统计学差异(P均lt;0.01);与模型组比较,高、中、低三个剂量组亦显示非常统计学差异(P均lt;0.01)。结果见表1。
表1 Tet对小鼠免疫器官指数的影响
2.2Tet对小鼠PMΦ吞噬功能的影响
结果表明,Tet高、中、低三个剂量组均能提高PMΦ吞噬百分率和吞噬指数。与正常组比较,Tet高、中剂量组有非常统计学差异(P均lt;0.01),低剂量组也有统计学差异(Plt;0.05)。与模型组比较,Tet高、中、低剂量组有非常统计学差异(P均lt;0.01)。结果见表2。
表2 Tet对小鼠PMΦ吞噬功能的影响
2.3Tet对小鼠PFC的影响
结果表明,Tet各组均能提高小鼠溶血值,增加PFC数,与正常对照组比较,高剂量组有非常统计学差异(Plt;0.01),中、低剂量组也有统计学差异(P均lt;0.05)。与模型组比较,高、中、低三个剂量组均有非常统计学差异(P均lt;0.01)。结果见表3。
2.4Tet对小鼠淋巴细胞转化率的影响
实验结果表明,Tet不同剂量均能提高淋巴细胞转化率。与正常对照组比较,Tet高剂量组有非常统计学差异(Plt;0.01);中、低剂量组也有统计学差异(P均lt;0.05)。与模型组比较,Tet高、中、低三个剂量组也显示出非常统计学差异 (P均lt;0.01)。结果见表4。
表3 Tet对小鼠PFC的影响
表4 Tet对小鼠淋巴细胞转化率的影响
在上个世纪90年代,有人研究发现,Tet是一种天然的免疫抑制剂,对细胞免疫和体液免疫均有抑制作用。Tet可通过干扰细胞跨膜信号传递,抑制分裂原刺激淋巴细胞增殖、B细胞合成抗体及NK细胞介导细胞毒性作用。Tet还可通过下调T细胞蛋白激酶C信号转导通路,抑制T细胞增殖,减少IL-2的分泌及下调T细胞激活抗原CD71的表达产生免疫均有抑制作用。Tet可剂量和时间依赖性的地引起小鼠腹腔巨噬细胞、豚鼠肺巨噬细胞和小鼠巨噬细胞样细胞系J774细胞活性丧失,抑制巨噬细胞呼吸爆发,减少氧自由基的生成,下调多种炎性细胞因子的合成与释放[4]。亦可剂量依赖性抑制内毒素、PMA及二氧化硅诱导肺泡巨噬细胞NF-KB的激活及NF-KB依赖性基因的表达,但对核转录因子SP-1的DNA结合活性及SP-1依赖报告基因无影响,这一作用与抑制IKB降解的某些信号转导通路、清除氧自由基有关[5]。Tet还可显著抑制N-甲酰基蛋氨酸、亮氨酸等诱导的嗜中性白细胞、巨噬细胞趋化蛋白-1表达上调、自由基聚集及对纤维蛋白原粘附[6]。Tet在体内外均有较好的免疫抑制作用,且与抗风湿药物具有协同作用,还可减少不良反应,但其机制不同于其他抗风湿药[7]。
雄黄中毒后,机体的免疫功能下降。我们研究发现,Tet在促进雄黄中毒动物砷排泄时,能调节其免疫功能。研究结果表明,给予Tet不同剂量时,能增加小鼠脾脏和胸腺指数,提高PMΦ吞噬百分率和吞噬指数,提高小鼠溶血值,增加PFC数,提高淋巴细胞转化率。这表明Tet在治疗雄黄中毒时,能发挥其双重作用。
[1]李祥华,高林,余万桂,等. 粉防己碱对雄黄中毒大鼠尿砷血砷含量的影响[J]. 中国医院药学杂志,2009,29(24):2083-2085.
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[编辑] 一 凡
10.3969/j.issn.1673-1409(R).2012.01.001
R963
A
1673-1409(2012)01-R001-03
2011 10 25
湖北省科技攻关项目(2006AA301C34)
李祥华(1953),男,湖北松滋人,教授,主要从事中医药学教学与研究工作。