LC-MS/MS检测血浆中黄连吴茱萸药对生物碱的研究*

★ 孙冬梅 罗文汇 李素梅 毕晓黎 李养学 (广东省中医研究所 广州510095)

药对是中药配伍应用的基本形式，虽组成简单，却有着严谨的配伍规律和特定的药理作用。开展中药药对配伍的物质基础和作用机理研究对探讨中药配伍规律具有重要意义，同时也为更有效地指导临床用药和中药新药研制提供科学依据。黄连与吴茱萸配伍是中医寒热配伍药对的代表之一，亦是现代临床的常用药对之一，有着良好的临床疗效和使用范围。具有泻火、疏肝、和胃、止痛等功效，屡经历代临床应用至今不衰［1－2］。本文建立了同时测定血浆中黄连-吴茱萸药对中四种生物碱浓度的高效液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)方法，并进行了方法学考察。结果表明，该方法灵敏度高，准确性好，样品处理简单，适合于黄连-吴茱萸药对中生物碱的血药浓度监测及药代动力学研究。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Accela高效液相色谱仪、TSQ Quantum Access Max三重四极杆质谱检测器(美国Thermo Fisher Scientific公司);TDL-5-L台式离心机(上海安亭);HSC-12A氮吹仪(天津Hengao);XW-80A旋涡混合器(上海青浦沪西);Advantage A10超纯水处理系统(美国Millipore公司)。

1.2 试药

盐酸小檗碱对照品(批号:110713-200609)、盐酸药根碱(批号:110733-200806)、盐酸巴马汀(批号:110732-200506)、吴茱萸碱(批号:110802-200606)购于中国药品生物制品检定所;甲醇、冰乙酸(MERCK色谱纯);高纯氮气(纯度＞99.999%);高纯氩气(纯度＞99.999%));水为超纯水。

2 测定方法

2.1 对照品储备液的配制

用40%甲醇溶液配制含盐酸小檗碱(397.72 μg/ml)、盐酸巴马汀(396.94 μg/ml)、盐酸药根碱(399.36 μg/ml)和吴茱萸碱(395.28 μg/ml)的生物碱对照储备液，置4℃冰箱中保存，使用时用40%甲醇水溶液稀释至所需浓度。

2.2 样品的处理

密吸取血浆样品0.4 ml，加甲醇 1 ml，摇匀，离心(3000 r/min，15 min)，离心后倾出上清液，上清液加甲醇 1 ml，摇匀，离心(3000 r/min，15 min)，倾出上清液，上清液用氮吹仪吹干，残渣加40%甲醇水溶液溶解并定容于1 ml容量瓶中，过0.45 μm的微孔滤膜，滤液作为供试品溶液。

2.3 液相色谱-质谱条件［3－4］

2.3.1 色谱条件 色谱柱为Hypersil GOLD C18柱(50 mm ×2.1 mm，3 μm);柱温:30℃;流动相:甲醇(A)－0.01%乙酸(B)按表1中的规定进行梯度洗脱;流速 0.2 ml/min;进样量:10 μl。

表1 流动相梯度表

2.3.2 质谱条件 高温电喷雾离子源(HESI源);正离子选择反应监测(SRM);喷雾电压:2.8kV;喷雾温度:350℃;毛细管温度:300℃;鞘气压力:35psi;辅助气流速:5arb;用于定量分析的离子对为336.122→320.135(26Hz)、352.163→336.181(29Hz)、338.170→307.215(39Hz)和 303.114→286.965(42Hz)。

2.4 测定方法

测试样品直接注入色谱仪中，按上述液-质条件采用inject/waste的方式进样检测。

3 结果

3.1 方法可行性考察

空白血浆、对照品、血浆样品的三个选择反应监测的离子流色谱图见图1－3。动物体内内源性物质及其他杂质不干扰样品的分离测定。(见图1－3)

3.2 标准曲线的制备

用40%甲醇水溶液将对照储备液稀释成含盐酸小檗碱(1.243、4.971、9.943、15.486、22.886、30.578 ng/ml)、盐酸巴马汀(1.240、4.962、9.924、15.481、22.847、30.541 ng/ml)、盐酸药根碱(1.248、4.992、9.984、15.496、22.968、30.647 ng/ml)和吴茱萸碱(28.432、80.271、160.434、272.374、384.652、553.314 ng/ml)系列质量浓度的生物碱对照品溶液，按“2.3”项下的测定条件进行分析、对待测物浓度C为自变量(X)，峰面积A为因变量(Y)，进行线性回归分析，得到的直线回归方程为:

图3 空白血浆HPLC-MS色谱图

盐酸小檗碱:Y=9.039 47×105+2.526 9×106X，r=0.999 4，线性范围为 1.243 ～30.578 ng/ml;盐酸巴马汀:Y=1.270 13 ×106+5.222 99 ×106X，r=0.999 5，线性范围为 1.240 ～30.541 ng/ml;盐酸药根碱:Y=3.009 34 ×103+1.650 52 ×105X，r=0.999 2，线性范围为 1.248 ～30.647 ng/ml;吴茱萸碱:Y=2.792 74 ×104X，r=0.999 4，线性范围为 28.432 ～553.314 ng/ml。

3.3 回收率实验

分别精密吸取1 ml空白血浆，分别加入高、中、低三种不同浓度的对照品溶液1 ml，混匀，制得三种浓度的血浆样品，按血浆样品的处理与测定项下方法进行测定，由标准曲线方程计算出血浆中生物碱浓度，以测得值与加入值之比计算回收率，结果见表2。

表2 四种生物碱回收率测定结果

3.4 精密度试验

将生物碱对照储备液准确配制成低、中、高3个质量浓度［含盐酸小檗碱(1.243、9.943、30.578 ng/ml)、盐酸巴马汀(1.240、9.924、30.541 ng/ml)、盐酸药根碱(1.248、9.984、30.647 ng/ml)和吴茱萸碱(28.432、272.374、553.314 ng/ml)］的溶液，每个浓度平行配制6份，按HPLC-MS条件进行分析，计算日内精密度，连续3天配制并测定上述浓度样品，每天随行做标准曲线，并以当日的标准曲线计算样品的浓度。将结果进行方差分析，计算日内精密度和日间精密度。低、中、高3个浓度日内精密度RSD分别为盐酸小檗碱:2.3%、3.2%、7.6%;盐酸巴马汀:2.6%、3.8%、6.5%;盐酸药根碱:2.5%、4.1%、8.2%;吴茱萸碱:1.7%、3.6%、6.8%。日间精密度分别为盐酸小檗碱:2.5%、3.7%、8.5%;盐酸巴马汀:2.9%、4.0%、7.1%;盐酸药根碱:2.8%、4.7%、9.1%;吴茱萸碱:2.2%、4.5%、7.4%。均 ＜15%。

3.5 样品稳定性试验

用空白血浆配制3个不同质量浓度［含盐酸小檗碱(1.243、9.943、30.578 ng/ml)、盐酸巴马汀(1.240、9.924、30.541 ng/ml)、盐酸药根碱(1.248、9.984、30.647 ng/ml)和吴茱萸碱(28.432、272.374、553.314 ng/ml)］的样品，进行稳定性试验。结果表明在4℃条件下保存1周，样品中药物浓度无明显变化，稳定性良好。

3.6 质控样品

用空白血浆配制［含盐酸小檗碱(1.243、9.943、30.578 ng/ml)、盐酸巴马汀(1.240、9.924、30.541 ng/ml)、盐酸药根碱(1.248、9.984、30.647 ng/ml)和吴茱萸碱(28.432、272.374、553.314 ng/ml)］样品各3份，每份进样分析2次，在每批样品测试中作为质控样品和标准曲线进行随行测定，结果表明质控样品的实际测定结果与真实值接近。

4 讨论

黄连吴茱萸药对生物碱在血浆中的浓度低，定量分析难度较大，采用常规方法进行分析测定灵敏度均无法满足生物样吕中微量药物测定的要求。本研究采用LC-MS/MS法进行血浆中黄连吴茱萸药对生物碱的测定，与HPLC-UV方法相比，本法的灵敏度高、专属性强，与已有报道的LC-MS/MS方法相比，本法具有预处理方法简单、分析时间短的优点，适用于药动学和生物利用度研究等生物样本的分析测定。

［1］张红梅，范颖.黄连与吴茱萸对药方的应用沿革及配伍内涵探析［J］.陕西中医学院学报.2010，33(6):107 －108.

［2］杨宏博，肖小河，赵艳玲，等.黄连、吴茱萸药对的研究进展［J］.中国药房.2010，21(15):1432 －1434.

［3］邓雅婷，廖琼峰，毕开顺，等.黄连-吴茱萸药对化学成分的HPLCDAD-MS分析［J］.药学学报.2008，43(3):299－302.

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