火绒草抑菌作用的物质基础研究△

姜鸿，单国顺，齐越，赵玥，尤献民

（辽宁省中医药研究院，辽宁 沈阳 110034）

中药科技

火绒草抑菌作用的物质基础研究△

姜鸿*，单国顺，齐越，赵玥，尤献民

（辽宁省中医药研究院，辽宁 沈阳 110034）

目的：探讨中药材火绒草抑菌作用的药效物质基础。方法采用SPSS统计分析方法，以36个色谱峰的相对峰面积为自变量，提取物的抑菌圈直径为因变量进行相关性分析和回归分析。结果得到36个色谱峰的相关系数。结论：初步确定火绒草中与16个色谱峰对应的化学组分具有抑菌活性，其中色谱峰X10为原儿茶酸，X13为原儿茶醛，X14为绿原酸，X16为咖啡酸。

火绒草；物质基础；相关分析；回归分析；抑菌作用

火绒草Leontopodium leontopodioides（Willd.）Beauv.为菊科火绒草属植物的干燥全草，味微苦，性寒；入肾、膀胱二经；具有清热凉血，消炎利肾的功效。对流行性感冒，急、慢性肾炎，尿路感染，尿血，创伤出血等症状有一定的疗效。火绒草具有抑菌作用已有报道［1］，但是其抑菌活性成分的研究未见报道。

本研究利用极性萃取法将火绒草提取液分成不同极性化学组分，对其不同化学组分进行体外抑菌试验，并与各提取物指纹图谱相对峰面积相关联，使用SPSS统计软件进行相关性和回归分析，初步确定火绒草中的抑菌活性物质，为火绒草抑菌药效物质基础的深入研究奠定理论基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器与试药

Agilent1100高效液相色谱分析仪：四元泵、DAD检测器、全自动进样器Agilent公司。电热恒温培养箱（厦门医疗电子仪器厂）；电子数显卡尺（桂林广陆数字测控股份有限公司）。

1.2 材料

原儿茶酸、原儿茶醛、绿原酸、咖啡酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号分别为110809-200604， 110810-200506， 110753-200413， 110885-200102）；乙腈、磷酸为色谱纯；水为娃哈哈纯净水；其他试剂均为分析纯；火绒草药材采自沈阳东陵祝家地区，经辽宁中医药大学药用植物教研室王冰教授鉴定为火绒草Leontopodium leontopodioides（Willd.）Beauv.。

MH（Mueller-Hinton）琼脂培养基，血琼脂培养基（温州市康泰生物科技有限公司）。金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、无乳链球菌、化脓链球菌、痢疾志贺菌、白色念珠菌（辽宁省临床检验中心）。

提取物制备：取火绒草药材1 000 g，去杂质，加18 000 mL水提取2次，每次1 h，量取1／2倍体积的提取液，减压干燥；剩余提取液置分液漏斗中，分别用石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇各萃取3次，合并萃取液，减压干燥；取经过上述溶剂萃取后的水溶液，减压浓缩至干。将5份提取物称重后粉碎，分别用糊精配制质量浓度为药材－糊精（10∶1）的1号提取物（水提物）、2号提取物（石油醚提取物）、3号提取物（乙酸乙酯提取物）、4号提取物（正丁醇提取物）和5号提取物（剩余提取物）。

2 方法与结果

2.1 提取物指纹图谱分析

2.1.1 色谱条件 色谱柱：Kromasil C18（200 mm×4.6 mm，5μm）；流动相A：0.2%磷酸水溶液，B：乙腈；梯度洗脱。流速：1 mL·min－1；检测波长：290 nm；柱温：25℃；记录60 min谱图。

2.1.2 供试品溶液制备 分别准确称取1～5号提取物各2 g，加蒸馏水50mL，称重。回流提取1 h，静置冷却至室温，称重，用蒸馏水补足失重，摇匀，经0.45μm滤膜滤过，分别取续滤液作为供试品溶液。

2.1.3 HPLC指纹图谱分析 取各供试品溶液，在上述色谱条件下进样，5个提取物以提取物1为准共得到36个色谱峰，见图1～5，用X1～X36分别代表各色谱峰校正后的峰面积。

图1 1号提取物的HPLC指纹图谱

图2 2号提取物的HPLC指纹图谱

图3 3号提取物的HPLC指纹图谱

图4 4号提取物的HPLC指纹图谱

图5 5号提取物的HPLC指纹图谱

将原儿茶酸、原儿茶醛、绿原酸和咖啡酸混合对照溶液进样，记录色谱图，并将保留时间与样品各指纹峰比较，确认10、13、14、16号峰分别为原儿茶酸、原儿茶醛、绿原酸、咖啡酸，见图6。

2.2 抑菌试验

2.2.1 试验方法 提取物分别用无菌蒸馏水配制成0.4 g·mL－1。将供试细菌的新鲜菌苔用白金耳接种至琼脂培养基，36.5℃恒温培养18 h后，将细菌溶于2 mL 0.9%氯化钠溶液中，配制成浊度为0.5的菌悬液。用无菌棉签蘸取0.1 mL菌悬液，均匀涂布于MH琼脂培养基及血琼脂培养基表面，用直径为8 mm的无菌打孔器在培养基上垂直方向打4个孔，相邻两孔的距离大于3 cm。每个平皿内分别加提取物药液、蒸馏水作为阴性对照，加两孔作为平行样，各做2个平皿，每孔加0.2mL药液，36.5℃恒温培养18 h。采用 “十字交叉”法测量抑菌圈直径，计算抑菌圈直径的平均值［2-3］。

2.2.2 提取物对供试菌株的抑菌作用 实验结果表明，肺炎链球菌、白色念珠菌对上述提取物均不敏感；金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、无乳链球菌、化脓链球菌、痢疾志贺菌对1、3、4、5号提取物表现为高度敏感（抑菌圈直径＞19 mm）或中度敏感（抑菌圈直径介于13～19 mm）［3］。结果见表1。

从实验结果可知，火绒草药材具有较强的抑菌作用，对许多致病菌，如金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、无乳链球菌、化脓链球菌、痢疾志贺菌等具有明显的抑制作用，这一结果也与文献报道相符。

2.2.3 数据统计 将指纹图谱化学数据和抑菌试验数据组成原始数据矩阵，自变量X1～X36代表各色谱峰校正后的峰面积，因变量Y1～Y6分别代表金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、无乳链球菌、化脓链球菌、痢疾志贺菌的抑菌圈直径，组成矩阵，采用SPSS软件进行数据处理，采用相关分析的方法探讨火绒草药材中抑菌的药效物质基础［4］。

2.2.4 相关分析 相关分析Correlate是研究变量之间密切程度的一种统计方法，当分析多个变量之间的关系，而这种关系又往往是变量之间的数量关系时，通常采用双变量Bivariate相关分析方法。使用SPSS软件（13.0版）中的双变量相关分析可以得到变量两两之间的皮尔逊系数（Pearson Correlation Coefficients）及其统计量。

表1 提取物对供试菌株的抑菌作用（n＝6）／mm

与Y1密切正相关的变量有：X11、X14、X16、X24、X25、X28、X30、X34；与 Y2密切正相关的变量有：X7、X11、X13、X14、X16、X24、X25、X28、X30、X31、X34、X35、X36；与 Y3密切正相关的变量有：X14、X16、X25、X35、X36；与 Y4密切正相关的变量有：X7、X14、X16、X28、X31、X36；与 Y5密切正相关的变量有：X13、X14、X24、X28、X34、X35；与 Y6密切正相关的变量有：X14、X16、X25、X35、X36。与这些色谱峰对应的化学成分可能是有效抑菌成分。

2.2.5 回归分析 采用 “有进有出”的回归分析方法，从一个自变量开始，视各自变量X对因变量Y作用程度的显著，将显著变量逐个引入回归方程，而原引入的变量因后引入的新变量而变得不显著时，则将其剔除，每一步都进行F检验，以保证方程中只包含显著变量。这个过程反复进行直到再无新变量引入，也无变量被剔除，逐步回归完成，建立回归方程。共有 X5、X14、X16、X17、X24、X28、X31、X36等20个变量被引入回归方程，其中X5、X17与提取物的抑菌作用呈负相关，与药效预期的结果相反，因此被剔除。在分析过程中同时发现有多重共线性情 况， 变 量 X7、X10、X11、X13、X18、X21、X25、X30、X34、X35与被引入的变量的相关系数接近1，且这些组分与Y值呈正相关，因此这10个化学组分可能是火绒草抑菌的药效物质。

经过相关和回归分析，可初步确定 X7、X10、X11、X13、X14、X16、X18、X21、X24、X25、X28、X30、X31、X34、X35、X36为火绒草抑菌的药效物质基础。

3 讨论

中药药效物质基础是中药现代化的研究核心，以中药的主要功效和配伍理论为指导，采用恰当的药理模型评价药效，利用现代分离、分析技术筛选、提取、分离与药效密切相关的化学成分群，进而阐明化学成分与药理活性的关系，确定中药药效物质基础，是中药现代化基础研究的主要内容。

本研究将指纹图谱技术运用于复杂成分的化学信息采集，将化学信息与药理实验结果相关联，对关联结果进行降维处理，得出与药效相关性比较大的少数组分作为药效物质基础，探索了中药药效物质基础研究的思路。综上所述，研究了中药火绒草的色谱指纹图谱和抑菌药效物质基础，初步将36个色谱峰中的16个确定为火绒草抑菌药效物质基础。本研究对中药药效物质基础研究进行了有意义的探索，对中药复方药效物质基础研究也有一定的借鉴意义。

中药材及中药复方药效物质基础研究是中医药现代研究的难点，主要体现在其化学成分的复杂性上，中药及其复方的化学成分通常有数十甚至上百种，而且药材来源、加工工艺、药味加减、剂量和配比等因素也会直接影响中药复方化学组成以及中药及其复方的疗效。目前，中药物质基础研究思路和研究方法尚不成熟，现有的研究方法主要有：传统的化学研究方法、拆方研究、中药有效部位研究、中药指纹图谱的研究、中药血清药物化学研究、代谢物组学、细胞膜生物色谱法等。我们采用中药指纹图谱化学信息与药理实验结果相关联的方法，确定了中药材具有药效作用的化学成分，为有效成分分离、鉴定及其药效作用的确定提供理论指导，是中药材及中药复方药效物质基础研究的有效手段。

［1］黄利权，伍义行.火绒草的抗菌活性研究［J］.中兽医医药杂志，2006，（1）：5-7.

［2］伍义行，王建国.火绒草抑菌作用试验研究［J］.时珍国医国药，2000，11（4）：289-290.

［3］陈林娜，周立勤，王汉敏，等.中药对临床耐药菌株的体外抑菌试验观察［J］.中华医院感染学杂志，2005，15（1）：118-120.

［4］沈岚，张梁，冯怡，等.芍药甘草复方效应组分谱效关系研究［J］.中国中药杂志，2009，33（22）：2658-2662.

Study on Antibacterial Substances in Leontopodium leontopodioides（W illd.）Beauv.

JIANG Hong，SHAN Guo-shun，QIYue，ZHAO Yue，YOU Xian-min（Medical Research Institute of Liaoning Province，Shenyang110034，China）

Objective：Study on the antibacterial pharmacodynaic material inLeontopodium leontopodioides（Willd.）Beauv..M ethods：SPSS statistical analysismethod was used for correlation and regression analysis by the relative area of 36 chromatographic peaks as independent variables，and bacteriostatic ring diameter of extracts as dependent variables.Results：Correlation coefficients of 36 chromatographic peaks were got.Conclusion：Chemical constituents inLeontopodium leontopodioides（Willd.）Beauv.corresponding with 16 chromatographic peaks were preliminary determined having antibacterial activity，in which，chromatographic peak X10is protocatechuic acid，X13is protocatechuic aldehhye，X14is chlorogenic acid，and X16is caffeic acid.

Leontopodium leontopodioides（Willd.） Beauv.；Material basis；Correlation analysis；Regression analysis；Antibacterial action

△［基金项目］辽宁省科技厅项目（2007403019）

*［通讯作者］姜鸿，Tel：（024）86803184，E-mail：jh0723＠126.com

2012-03-22）