外周血Survivin mRNA表达与胃癌的关系

邓建忠,金建华,陆文斌,王 芳,李献文

(江苏大学附属武进医院肿瘤内科,江苏常州,213002)

胃癌是中国最常见的胃肠道肿瘤之一,因其早期症状不明显,大多数患者被确诊时病程已至进展期。Survivin是新近发现的一种凋亡抑制基因,选择性地在肿瘤中表达。作者前期研究发现,其也表达于胃癌患者的外周血中,而且具有抑制细胞凋亡,调控细胞周期及参与血管形成的作用[1]。因此,检测外周血中Survivin的表达,有可能成为检测肿瘤复发或转移及判断预后的参考指标之一。本研究旨在探讨外周血survivin mRNA的表达水平与胃癌发生、发展的作用及预后价值。

1 材料与方法

1.1 材料

选择2007年10月～2009年8月在江苏大学附属武进人民医院肿瘤科、消化内科和外科就诊并经胃镜活检组织及术后病理确诊为胃癌患者55例(转移28例,未转移 27例),男 30例(转移19例,未转移 11例),女 25例(转移 17例,未转移8例)。年龄 32～72岁,中位年龄 58岁。TNM 分期:Ⅰ期3例,Ⅱ期9例,Ⅲ期15例,Ⅳ期28例。采用2002年第6版AJCC胃癌TNM分期标准进行分期。所有患者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 外周血总RNA的提取、完整性和纯度检测:根据试剂盒操作说明,应用Trizol Reagant按照说明书进行提取RNA,所提取的总RNA用紫外分光光度计定量并检测其纯度。A260/A280≥1.8为合格。所提取的总RNA完整性经琼脂糖电泳鉴定。-70℃保存待用。

1.2.2 cDNA 合成:20 μL反应体系中含:总RNA 1 μg,10 ×缓冲液 2 μL,dNTPs(10 mmol/L)2 μL,100 ng 随机引物 ,M-MLV(10 U/μL)2 μL,加DEPC水至20 μL。逆转录反应条件为:37℃60 min,95℃5 min,70℃保存待用。

1.2.3 实时荧光定量PCR(RT-PCR):利用DNAman软件设计RT-PCR Survivin和管家基因GAPDH的引物:GAPDH上游引物为 5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′,下游引物为5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′, 探针序列为 5′-CAAGCT TCCCGTTCTCAGCC-3′;Survivin上游引物为5′-TGCCCCGACGTTGCC-3′, 下游引物为 5′-CAGTTCTTGAATGTAGAGATGCGGT-3′,探针序列为 5′-CCTGGCAGCCCTTTCTCAAGGACC-3′。 用 RTPCR法检测患者外周血中Survivin mRNA的表达水平,GAPDH为内参照,PCR试剂盒、引物及探针合成中山医科大学达安基因有限公司提供。50?L RT-PCR反应体系中含:1×定量缓冲液 ,200 μ mol/L dNTPs,5 UampliTaq Gold,Survivin上下游引物各600 nmol/L,荧光探针200 nmol/L,100 ng cDNA,反应条件为:50℃10s,95℃10 min,然后95℃30s,60℃1 min,共40个循环,PCR反应结束后,根据标准曲线仪器自动进行分析,对每一份标本均设副孔,采用GAPDH为内参基因,以Survivin/GAPDH的比值计算出待测样品的拷贝数。

1.2.4 统计学方法:共有55例患者入组,到随访终止时仍有3例患者(Ⅰ期2例,Ⅱ期1例)未出现疾病进展。生存分析采用Kaplan-Meier方法。计量资料采用秩和检验,用Cox比例风险模型评估影响预后生存的各变量。采用双侧检验,检验水准α=0.05。所有资料均应用SPSS 13.0统计软件包进行统计学处理。

2 结 果

2.1 Survivin mRNA检测结果

可评估的52例患者化疗前Survivin mRNA表达水平为0.6012±0.0496,疾病进展后Survivin mRNA表达水平为0.7190±0.0961(P=0.006)。

2.2 预后因素分析

运用Cox回归模型对可能影响胃癌患者预后的各种因素,包括年龄、性别、淋巴结转移、Survivin表达、分期等进行回归分析,结果发现:分期、Survivin mRNA的表达水平是影响胃癌预后的独立因素(表1)。

表1 COX模型筛选的胃癌危险因素及其参数

3 讨 论

Survivin基因定位于染色体17q25,是凋亡抑制蛋白(IAP)家族中新成员,Survivin具有抑制细胞凋亡,调控细胞周期及参与血管形成的作用[1-4]。胃癌的发生发展是一个多基因、多步骤的复杂过程。正常细胞脱离原来组织时,即启动凋亡过程,因而不会形成远隔部位的增殖。癌细胞从原发瘤体脱落后,最终形成癌转移,可能有部分是由于Survivin对癌细胞凋亡抑制的原因;当外周血中的癌细胞达到一定数量,即可体现为Survivin表达。因而Survivin对于胃癌的发生发展可能是很重要的。

作者的前期研究发现:正常胃炎患者外周血未检测到Survivin mRNA的表达,在胃癌患者外周血中Survivin表达检测率为 86.0%,与Survivin在胃癌周围正常组织中几乎不表达,而在胃癌组织中100%表达[5]的研究结论基本相似。张红燕等[6]应用RT-PCR方法检测食管癌组织Survivin基因表达的研究认为:Survivin基因在食管癌发生的早期阶段即被激活,因此认为其可将作为食管癌发生早期阶段的分子标志物。作者应用敏感的Real-time RT-PCR技术发现:Survivin在胃癌外周血中的表达是一个渐进的过程,随着癌前病变向癌浸润及最后出现转移的发展,Survivin mRNA的表达水平逐渐增高,说明Survivin mRNA表达水平是随着病情的变化而升高,且它的异常表达发生在胃癌早期。因此可以认为:Survivin可能可以作为胃癌早期诊断的一个生物分子。

虽然先前有很多与胃癌预后评估有关的分子标志报道,但是能够真正地成为胃癌的独立预后因素却不多。Survivin在恶性肿瘤的表达及预后评估的意义也有很多报道:Bertazza等[7]报道Survivin在胃癌中的表达率为98.6%,并且可以预测胃癌患者的预后;Hoffmann等[8]研究认为Survivin mRNA高表达预示着食管癌患者不良预后。但是外周血Survivin mRNA表达与胃癌预后关系的探讨却鲜有报道。本研究显示:52例可以评估的患者化疗前外周血Survivin mRNA表达水平较疾病进展后的表达水平低(P<0.05)。运用Cox回归模型进行回归分析发现:分期、Survivin mRNA的表达水平是影响胃癌预后的因素,提示外周血Survivin的检测可作为临床评估胃癌患者预后的指标。

Survivin在正常人的外周血中不表达,而后随着胃癌的发生和发展,它在外周血中表达水平渐升高,并且影响胃癌患者的预后,我们认为它就可以作为胃癌早期诊断,判断胃癌预后的客观指标之一。作者也期待能够得到大样本多中心研究结论的证实,可以使Survivin成为胃癌预后的一种分子标志。

[1]Ambrosini G,Adida C,Altieri D C.A novel anti-apoptosis gene,Survivin,expressedin cancer and lymphoma[J].Nature Med,1997,3(8):917.

[2]杨增周,席鸿钧,侯进荣.Survivin在食管鳞癌发生发展中的作用[J].新乡医学院学报,2008,25(4):349.

[3]崔 斐,陈 斌,陈锦章,等.凋亡抑制蛋白Survivin和血管内皮生长因子在肝细胞癌中的表达及其临床意义[J].南方医科大学学报,2008,28(5):761.

[4]张艳萍,石太新,范艳芬,等.凋亡抑制蛋白Survivin在儿童急性白血病中的表达及临床意义[J].新乡医学院学报,2008,25(4):360.

[5]Meng H,Lu C,Mabuchi H,et al.Prognostic significance and different properties of Survivin splicing variants in gastric cancer[J].Cancer Lett,2004,216(2):147.

[6]张红燕,李珊珊,郝宝岚.食管癌癌组织中Survivin基因的表达及临床意义[J].山东医药,2007,47(26):33.

[7]Bertazza L,Mocellin S,Marchet A,et al.Survivin gene levels in the peripheral blood of patients with gastric cancer independently predict survival[J].J T ransl Med,2009,22(7):111.

[8]Hoffmann A C,Vallbohmer D,Grimminger P,et al.Preoperative survivin mRNA detection in peripheral blood is an independent predictor of outcome in esophageal carcinoma[J].J Pharmacogenomics,2010,11(3):341.