血必净注射液对硫化氢急性中毒大鼠肺组织氧化应激及Nrf2基因表达的干预作用

葛 赟 卢中秋 洪广亮 姜小珍 刘 瑶 胡国新 邱俏檬

硫化氢(H2S)是一种窒息性毒剂，吸入浓度＞284mg/m3时即可导致中毒性肺水肿，甚至急性呼吸窘迫综合征，病死率达30%以上［1］。目前认为，H2S急性中毒不仅与细胞色素氧化酶的抑制有关，还与氧化应激损伤密切相关。核转录因子红系相关因子－2(Nrf2)是细胞内氧化应激反应中的关键性因子，近年来发现Nrf2在急性肺损伤中占有重要的地位，其活化后通过调节下游抗氧化酶类得基因表达，减轻氧化应激损伤，发挥细胞保护作用［2，3］。血必净注射液(XBJ)主要成分有丹参素、川穹嗪、红花黄色素A、赤芍等组成的中药制剂，具有清除自由基、抗炎、改善免疫功能、保护组织细胞的作用［4］。本研究观察在大鼠H2S中毒急性肺损伤模型中，肺组织Nrf2表达和体内氧化应激水平的动态变化，并通过XBJ的干预，探讨其治疗机制。

材料与方法

1．实验动物:雄性SD大鼠96只，2～3个月龄，体重220±40g，动物实验前8h禁食，4h禁水，由温州医学院实验动物中心提供［动物许可证编号:SCXK(沪2007－0005)］。

2．主要试剂:XBJ(规格:10毫升/支，天津红日药业股份有限公司，国药准字Z20040033);H2S气体(天津赛美特特种气体有限公司);MDA、SOD、CAT、GSH － Px、GSH 试剂盒(南京建成生物工程研究所);BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天科技研究所);RNA提取试剂Trizol Reagent(美国Invitrogen公司);反转录试剂盒(美国Fermentas公司);PCR试剂盒(美国Fermentas公司)。

3．实验动物分组及给药:将96只SD大鼠随机分为正常对照组(n=8)、XBJ对照组(n=8)、H2S 染毒组(n=40)、XBJ干预组(n=40)。正常对照组:正常大鼠置于染毒柜内，进行假染毒1h(通入与H2S同样流量的空气，其余条件与H2S染毒组完全一样)，取出大鼠，2h后处死;XBJ对照组:正常大鼠在染毒柜内进行假染毒后给予XBJ(10m l/kg)腹腔注射，2h后处死;H2S染毒组:正常大鼠予H2S(284mg/m3)暴露吸入1h，构建大鼠H2S急性染毒模型;XBJ干预组，建立模型后立即予XBJ 10ml/kg 腹腔注射，后两组分别于给药后 2、6、12、24、48h时间点处死，每组8只。

4．组织标本处理:按各时间点处死大鼠，取左上肺组织，立即放入液氮中并及时转入－80℃冰箱中冻存，留作提取RNA以检测肺组织Nrf2 mRNA表达。取左下肺组织，迅速放入4%多聚甲醛中固定，以进行肺组织病理学观察。取右肺组织制成10%组织匀浆，用于 MDA、SOD、CAT、GSH－PX及GSH水平检测。

5．肺组织 MDA、SOD、CAT、GSH －Px及 GSH 指标检测:取10%肺组织匀浆，BCA法测定其蛋白浓度，化学比色法测定MDA、SOD、CAT、GSH－PX及GSH水平。

6．肺组织Nrf2 mRNA表达检测:按照试剂盒说明书，提取肺组织总RNA，进行RT－PCR。Nrf2及β－actin引物均由上海生工工程技术有限公司合成。Nrf2基因(产物长度113bp):上游 5'－ TCAGCTACTCCCAGGTTGCCCA －3'，下游5'－GGCAAGCGACTCATGGTCATCTAC －3'，β －actin(产物长度200bp):上游 5'－CCTTCCTTCCTGGGTATGGATCC －3'，下游5'－GAGCAATGATCTTGATCTTCATGGTG－3'。PCR产物以2%琼脂糖电泳检测，用凝胶图像分析仪扫描图像，再进行光密度分析。

7．肺组织病理学检查:取出4%多聚甲醛中固定的肺组织，石蜡包埋，连续切片，HE染色，观察肺组织病理学改变。

8．统计学方法:所有数据采用SPSS 16．0统计软件分析，数据以均数±标准差(x±s)表示，多组间采用单因素方差分析，两两比较用LSD检验，方差不齐则进行秩和检验，以P＜0．05为差异有统计学意义。

结 果

1．大鼠行为学变化:H2S染毒组和XBJ干预组在染毒15min后大鼠出现活动增加，呼吸明显加快;30min出现明显烦躁不安，口唇发绀;1h后(染毒结束)大鼠活动明显减少，蜷缩少动，对外界刺激反应淡漠，肢端和口唇发绀，呼吸困难。染毒结束后2h精神萎靡，活动少，呼吸稍加快，口唇发绀;6h后活动较前增加，呼吸较前平稳，口唇无明显发绀。XBJ干预组大鼠症状较H2S染毒组明显减轻。正常对照组和XBJ对照组大鼠活动状态正常，自由活动，无中毒表现。

2．各组大鼠肺组织SOD、MDA、CAT、GSH －Px及GSH测定结果:见表1。与正常对照组相比，XBJ对照组SOD、CAT、GSH－Px活力值及MDA、GSH含量无统计学意义差异(P＞0．05)。与正常对照组比较，H2S染毒组大鼠肺组织在2、6、12h SOD、CAT活力和GSH含量及在2、6、12、24h GSH －Px活力明显降低(P ＜0．05)，在2、6、12、24h MDA 含量明显升高(P ＜0．01)。与H2S染毒组比，XBJ干预组大鼠肺组织在2、6、12h CAT 活力和 GSH 含量及在2、6、12、24h SOD和GSH －Px活力明显升高(P ＜0．05)，在2、6、12h的MDA含量明显降低(P＜0．05)。

表1 各组大鼠肺组织MDA、GSH含量及SOD、CAT、GSH－PX活力的变化(x ± s，n=8)

3．各组大鼠肺组织Nrf2 mRNA的表达:见表2、图1。正常对照组与XBJ对照组肺组织Nrf2 mRNA少量表达，两组比较差异无统计学意义差异(P＞0.05)。与正常对照组比，H2S染毒组与XBJ干预组各时间点Nrf2 mRNA表达明显增加(P＜0．05)，在6、12、24、48h时间点 XBJ干预组 Nrf2 mRNA 表达明显高于H2S染毒组(P＜0．01)。

表2 各组大鼠肺组织Nrf2 mRNA表达的变化(x ± s，n=8)

图1 RT－PCR检测结果

4．光镜下肺组织病理学检查结果:见图2～图5。正常对照组和XBJ对照组大鼠肺泡清晰，肺泡壁薄，肺泡壁及间质内无炎性细胞浸润，未见充血、水肿。H2S染毒组各时间点大鼠肺泡壁明显充血、增厚，肺泡壁和肺间质内可见较多红细胞和白细胞浸润及其肺泡结构的破坏，在24h时间点呈高峰。XBJ干预组大鼠肺泡结构较为清晰，肺泡壁稍增厚，伴有少量炎性细胞浸润。

图2 正常对照组大鼠肺组织病理(HE，×200)

讨 论

近年来研究发现，氧化应激损伤参与了H2S中毒急性肺损伤的病理生理过程，在急性肺损伤过程中可产生了大量氧自由基，导致细胞通透性增加，细胞水肿甚至溶解坏死。氧自由基作用核酸、蛋白质和膜脂质等多种物质，而脂质过氧化是自由基损伤的主要机制之一［5，6］。同时，肺组织可产生多种内源性细胞保护物质，如 SOD、CAT、GSH － Px、GSH 等，它们能有效清除氧自由基，抗氧化损伤。生物体内存在这种氧化系统/抗氧化系统的动态平衡，一旦失衡，就会造成组织细胞的损害，而肺脏则是最易受损的靶器官之一。

现已证明，Nrf2/ARE通路在机体抗氧化还原方面起着极其重要的作用。在氧化应激原作用下，转录因子Nrf2与胞质蛋白伴侣分子(keleh－like ECH－associated protein 1，Keap1)解离活化，迅速入核，与抗氧化反应元件(antioxidant response element，ARE)相结合，启动第Ⅱ相抗氧化酶及解毒酶基因表达，上调细胞内一些重要抗氧化物质的水平(如SOD、CAT、GSH－Px、GSH等)，增加细胞对氧化损伤的抗性，发挥细胞保护作用［7，8］。据报道，在氟中毒早期，机体可通过启动Nrf2/ARE信号通路，使SOD、CAT、GSH－Px等抗氧化酶表达上调，增加细胞对氧化应激的抗性，达到清除自由基的目的［8，9］。Shih 等［10］发现脑缺血内Nrf2表达增加，而激活Nrf2/ARE通路则增加脑组织内GSH含量，减轻缺血性脑损伤。新近研究表明，体内Nrf2活性水平降低与严重创伤患者急性肺损伤的发生密切相关［11］。笔者的研究结果显示，正常对照组和XBJ对照组Nrf2 mRNA表达少量，但H2S染毒组Nrf2 mRNA表达水平明显增加，转而迅速下降，接近正常水平。表明H2S中毒急性肺损伤早期，在氧化应激状态下，Nrf2－ARE通路被激活，发挥重要的抗氧化作用，但是Nrf2在短时间内升高后又迅速下降，抗氧化应激损伤作用减弱，肺损伤加重。因此，Nrf2表达水平的变化可以反应肺脏氧化应激损伤程度和细胞保护的水平，调节并提高中毒后细胞内Nrf2活性及抑制氧自由基的大量产生，可能是对抗H2S毒性，减轻肺损伤的有效措施。

众所周知，CAT、SOD和GSH－Px都是机体内最重要的抗氧化酶类，它们分别能催化细胞内过氧化氢的分解、有效清除代谢过程中产生的超氧阴离子自由基和催化还原型GSH变为氧化型GSH，使细胞免于遭受过氧化氢和自由基的毒害，从而保护细胞膜的结构及功能不受过氧化物的干扰及损伤。除此之外，GSH是也是一种重要的自由基清除剂，可清除超氧离子、过氧化氢等，其含量多少是衡量机体抗氧化能力大小的重要标志。另外，MDA是脂质过氧化过程中形成的主要产物，可干扰细胞的正常功能活动，测定MDA浓度可直接反映自由基产生的程度，间接反映细胞损伤的程度。我们的实验结果表明，H2S中毒急性肺损伤早期在肺组织内在MDA含量明显升高，而SOD、CAT、GSH－Px活力及 GSH含量呈明显降低，表明在H2S中毒早期肺组织各种抗氧化物质水平明显下降，氧化应激损害在急性肺损伤中发挥着重要的作用。

XBJ具有很强的抗脂质过氧化、清除氧自由基的作用，对应激性脏器损伤具有良好的保护作用，并通过保护血管内皮细胞，改善器官超微结构损伤［4］。笔者课题组研究也发现，在LPS致急性肺损伤大鼠早期给予XBJ干预可显著降低急性肺损伤大鼠MDA水平，升高SOD等抗氧化酶类活力，减轻肺组织损伤。本研究表明，XBJ能持续上调肺组织Nrf2的基因表达，提高H2S中毒大鼠抗氧化能力，降低MDA水平，提高SOD、CAT、GSH－Px活力和GSH含量，发挥细胞保护和抗氧化应激损伤作用，综上所述，XBJ对H2S中毒急性肺损伤有一定的治疗价值，这为H2S中毒急性肺损伤机制的深入研究和H2S中毒的救治提供良好的前景。

1 胡振华，唐杰．上海市132例急性硫化氢中毒分析［J］．环境与职业医学，2007，24(6):616 －618

2 Toyokuni S，Akatsuka S．Pathological investigation of oxidative stress in the post－ genomic era［J］．Pathol Int，2007，57(8):461 －473

3 Marzec JM，Christie JD，Reddy SP，et al．Functional polymorphisms in the transcription factor NRF2 in humans increase the risk of acute lung injury［J］．FASEB J，2007，21(9):2237 － 2246

4 李忠旺，邱俏檬，孙琦，等．血必净注射液对创伤弧菌脓毒症大鼠肺组织Toll样受体4及核转录因子－κB表达的影响［J］．中国中西医结合急救，2010，17(1):24 －27

5 关望，王海英，陈志芳，等．外源性硫化氢对急性肺损伤大鼠氧化应激的调节作用［J］．当代医学，2010，16(18):7 －8

6 葛赟，孙未，吴宗盛，等．硫化氢急性中毒大鼠肺组织氧化应激及Nrf2基因表达的改变及乌司他丁的影响［J］．中华劳动卫生职业病杂志，2012，30(1):27 －32

7 葛赟，余毅娟，郑嘉奕，等．乌司他丁对硫化氢急性中毒大鼠肺组织氧化应激损伤的干预作用及机制研究［J］．中华急诊医学杂志，2012，21(2):164 －170

8 Olivier B，Laura AM．Molecular mechanisms of fluoride toxicity［J］．Chemico － Biological Interactions，2010，188(2):319 －333

9 Xu H，Zhou YL．Activation of PERK signaling through fluoride－mediated endoplasmic reticulum stress in OS732 cells［J］．Toxicology，2010，277(1 －3):1 －5

10 Shih AY，Li P，Murphy TH．A small－molecule－inducible Nrf2－mediated antioxidant response provides effective prophylaxis against cerebral ischemia in vivo［J］．Neurobiology of Disease，2005，25(44):10321－10335

11 Cho HY，Reddy SP，Yamamoto M，etal．The transcription factor NRF2 protects against pulmonary fibrosis［J］．FASEB J，2004，18(11):1258－1260