幽门螺杆菌毒力蛋白CagA诱导AGS细胞IL-8mRNA表达的研究

2012-11-05 09:23张亚南黄柳桓康熙雄
中国实验诊断学 2012年4期
关键词:螺杆菌宿主幽门

张亚南,黄柳桓,康熙雄

(1.首都医科大学附属北京天坛医院 检验科,北京100050;2.首都医科大学石景山教学医院 北京市石景山医院 胸心血管外科,北京100043)

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)是全世界高感染率的慢性感染性致病菌,在我国普通人群的感染率高达50%-80%。自从Marshall和Warren分离培养出幽门螺杆菌以来[1],幽门螺杆菌与慢性胃炎、溃疡、胃肿瘤和胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)等多种疾病相关[2],幽门螺杆菌被世界卫生组织(WHO)定为一类致癌原(1994年国际癌症研究大会),但是其致病机制仍不清楚。

根据是否含有40-Kb cag病原岛(cag pathogenicity island,cag PAI),幽门螺杆菌被分成两型:I型和II型[3]。I型幽门螺杆菌包含cag PAI,可引起更严重的胃粘膜变化。cag PAI有31个基因,CagA蛋白是唯一已知的由cag PAI编码的功能蛋白。酪氨酸 磷 酸 化 发 生 在 cagA 的 Glu-Pro-Ile-Tyr-Ala(EPIYA)motif上,从西方型(WSS-type)H.pylori主要 由 EPIYA-A,-B 和-C 构成,而东方 型 (ESS-type)H.pylori主要 由 EPIYA-A,-B 和-D 构成。西方型菌株约70%的H.pylori有cagA基因,而东亚地区如我国90%以上H.pylori含有cagA基因。东方型幽门螺杆菌比西方型幽门螺杆菌表现更显著的细胞形态的改变和更严重的感染症状,进而,携带CagA蛋白越多的幽门螺杆菌比携带相对较少的CagA蛋白具有更强的毒性,并且与胃癌更密切相关[4,5]。正因为cagA的EPIYA重复机制与西方型和东方型CagA生物活性相关,也就能够解释不同地域因幽门螺杆菌感染而发展成胃癌的发病率的不同[6,7]。

我们前期研究结果显示西方型幽门螺杆菌和东方型幽门螺杆菌感染细胞后[8,9],CagA蛋白动态变化不同,细胞分泌IL-8动态变化不同,证明不同基因型的幽门螺杆菌感染细胞出现不同的感染结局,如胃癌、胃炎及胃溃疡等,疾病发展结局与其感染幽门螺杆菌基因型相关。本文将继续讨论不同基因型H.pylori感染细胞后,IL-8mRNA动态表达水平是否与CagA蛋白相关,进而讨论幽门螺杆菌的致病机制。

1 材料与方法

1.1 细胞系和幽门螺杆菌

在37℃、5%CO2环境下,用含10%胎牛血清(Biochrom Ltd)的细胞培养液 RPMI 1640+7(Nikken bio medical)培养AGS细胞(人胃癌上皮细胞,ATCC CRL1739c)。

试验菌株野生型 H.pylori 26695(WSS-type CagA)和 HPK5(ESS-type CagA),每株野生型 H.pylori的cagA基因敲除株(cagA disrupted mutant strain)26695CA 和 HPK5CA[10]。菌株培养于含10%马血清的布氏肉汤(BD)中,置于5%O2、10%CO2和85%N2混合气体的微需氧培养箱中增菌培养。用600nm(OD600)分光光度计(GeneQuant,Biochrom Ltd)测定吸光度和菌落形成单位(colonyforming units(CFU))评估细菌生长状态[11]。

1.2 cagA基因

模版DNA制备采用基因组DNA提取试剂盒(QIAGEN)提取H.pylori DNA。取DNA 1μl为模版进行PCR扩增,引物为:cagA,5′-TGCATGCAGGAGAAACAATGACTAACG-3′(sense)和cagA,5′-TGCTTAATTAAGATTTTTGGAAACC-3′(antisense)。PCR扩增条件:96℃变性2min;95℃变性15sec,56℃退火15sec,72℃延伸4min,40个循环;终止延伸72℃5min。PCR产物经0.7%琼脂糖凝胶电泳,0.5mg/L溴化乙锭染色紫外线显影。

1.3 H.pylori感染细胞试验

将AGS细胞 (0.5×106)用RPMI1640+7培养液培养在六孔培养板(Sumitomo Bakelite)培养两天,用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗两次,按照细菌与细胞比例(multiplicity of infection,MOI)150,用RPMI 1640(Invitrogen)配制的菌液,感染细胞,同时以不加入细菌的AGS细胞作对照,置培养板于37℃微需氧条件培养,分别收集3小时、6小时、12小时、24小时和48小时的感染细胞,检测IL-8mRNA。

1.4 同步感染试验

用含10%胎牛血清的RPMI 1640+7培养液培养AGS细胞于6孔培养板中,培养两天,当单层细胞达到30% 细胞生长状态(cell confluence)时,用PBS冲洗细胞,按照MOI 150将细菌加入培养板中,离心600xg,5min,将培养板置于温箱孵育,在相应的时间收集标本。

1.5 RT-PCR

用RNA TRIzol试剂盒提取幽门螺杆菌感染细胞和未加幽门螺杆菌的对照AGS细胞(Invitrogen),按说明书操作。抽提RNA经过DNase(Promega)处理后,反转录酶PowerScriptTMReverse transcriptase(Clontech)合成cDNA。cDNA引物IL-8:5′ATGACTTCCAAGCTGGCCGTGGC-3′(sense)和 IL-8 5′TCTCAGCCCTCTTCAAAAACTTCTC3′(antisense)[12]。扩增条件:94℃变性1min;94℃变性1min,60℃退火1min,72℃延伸2min,30个循环;终止延伸72℃5min。核蛋白L7a为对照,L7a引 物: 5′-TTTGGCATTGGACAGGACATCC-3′(sense)和 5′-AGCGGGGCATTTCACAAAG-3′(antisense)[13]。L7aPCR 反 应 条 件:95℃ 变 性1min;94℃变性30sec,57℃退火20sec,72℃延伸1min,32个循环;终止延伸72℃5min。

2 结果

2.1 H.pylori诱导IL-8mRNA表达

为验证幽门螺杆菌是否诱导IL-8mRNA产生,我们用野生型 H.pylori 26695和 HPK5以MOI 150:1感染AGS细胞,AGS细胞被H.pylori感染后显示IL-8mRNA呈现时间依赖性(time-dependent)升高(图1),即AGS被H.pylori 26695感染3小时后IL-8mRNA升高,持续升高直至感染48小时,结果提示幽门螺杆菌感染细胞后诱导细胞炎症因子IL-8基因表达。对照未感染细菌的AGS细胞没有IL-8mRNA表达。

2.2 不同野生型菌株产生IL-8mRNA不同

为验证不同菌株H.pylori感染细胞后是否诱导IL-8产生不同的模式,我们用 WSS-type 26695和ESS-type HPK5感染 AGS,显示IL-8mRNA呈现不同升高模式(图1)。H.pylori HPK5时间依赖性(time-depedent)增加模式表现为感染3小时后升高,随后降低,12小时再次出现峰值,随后降低,在整个感染过程中均有IL-8mRNA表达。

2.3 cagA 基 因 突 变 株 (cagA-discrupted mutant strain)诱导IL-8mRNA表达

为验证cagA基因突变是否影响IL-8mRNA表达,我们用cagA基因突变株H.pylori 26695CA和HPK5CA以 MOI 150:1感染AGS细胞,显示AGS细胞被H.pylori cagA基因突变菌株感染后IL-8mRNA 呈现时间依赖性(time-dependent)升高,持续升高至48小时(图1)。结果提示AGS细胞IL-8mRNA升高不仅受cagA基因影响,还有其他因素参与IL-8mRNA的表达调控。

2.4 不同cagA 基因突变株(cagA-discrupted mutant strain)诱导IL-8mRNA表达不同

突变株26695CA和HPK5CA感染细胞后IL-8 mRNA表达不同(图1),26695CA感染3小时后升高,持续至48小时,峰值表现在6小时和12小时;而HPK5CA感染3小时后未升高,6小时迅速达峰值,随后降低,48小时又出现峰值。结果提示不同cagA基因型菌株表达IL-8mRNA不同。

图1 幽门螺杆菌感染AGS细胞IL-8mRNA的RT-PCR 2%琼脂糖凝胶电泳图

3 讨论

幽门螺杆菌慢性持续感染可导致胃粘膜产生白细胞介 素,虽 然 白 细 胞 介 素 (IL)-1B,IL-1RN 和TNF-A多态性与胃癌和胃溃疡相关[14],但是IL-8基因是否与胃疾病相关还不清楚。细菌感染细胞后,引 起 促 炎 细 胞 因 子 (pro-inflammatory cytokines)升高、抗炎细胞因子(anti-inflammatory cytokines)降低的H.pylori感染易引起胃癌和胃溃疡发生,反之易导致胃粘膜反应。

在幽门螺杆菌感染细胞的过程中,cagA基因编码的CagA蛋白运输到胃上皮细胞,定位于细胞的浆膜面,CagA通过依赖或不依赖Src家族蛋白激酶发生酪氨酸磷酸化与多种细胞蛋白作用,调控细胞生长和运动相关的信号通路,使胃上皮细胞发生转化而致癌变,引发一系列瀑布式级联反应,激活一系列信号事件,细胞出现伸展、扩散及形态改变为特征的蜂鸟表型[15,16]。同时,诱导IL-8mRNA 时间依赖性表达,西方型菌株与东方型菌株感染细胞后表达IL-8mRNA模式不同;cagA基因突变株同样可诱导IL-8mRNA表达且不同突变菌株IL-8mRNA模式不同;我们曾报导H.pylori感染AGS的IL-8动态分泌水平[8,9],26695(峰值12小时)和 HPK5(峰值48小时)在感染细胞过程中IL-8持续升高;突变株虽然在感染早期IL-8表达低浓度,但是在48小时突变株与野生株无显著差异,这些数据提示IL-8基因和其蛋白表达不仅与CagA蛋白相关,还与其他信号通路相关,如H.pylori的PI3K/Akt通过 NF-kB诱导IL-8 产生[17]。考虑到不同 H.pylori泳动速度不同,菌株感染接触细胞的时间可能影响IL-8mRNA的早期表达水平,我们采用同步感染试验,给予不同菌株相同外力,使细菌以相同速度感染细胞,探求IL-8表达水平,证明同步感染试验与非同步感染试验IL-8表达无差异。本文提示cagA基因是诱导细胞表达IL-8mRNA的重要因子,但并非是唯一因素,验证幽门螺杆菌感染宿主致病机制的复杂性。幽门螺杆菌感染的临床表现各异,大部分感染者终生无症状,出现不同感染结局的原因之一是:幽门螺杆菌在长期进化过程中,在不同人群和压力等不同环境条件下为适应宿主生存环境形成了基因高度多态性,以利于获得生存,在持续感染过程中繁殖,正是因为基因多态性导致菌株之间存在致病力的差异,在西方和东方人群H.pylori基因型分布不同能够解释导致胃疾病的不同发病率及结局。同时,幽门螺杆菌感染致病不是一种因素作用的结果,而是其多种因素整体作用及细菌与宿主细胞相互影响的综合结局[18,19]。

菌株之间的毒力因子的基因差异不仅影响感染宿主导致疾病而且也影响炎症和胃酸输出。在感染宿主过程中,H.pylori可能会为适应宿主而发生突变、DNA置换产生新的基因型。本研究证明了幽门螺杆菌在感染宿主过程中诱导与感染相关的炎症因子IL-8基因表达,如果采用降低或抑制IL-8表达,以求缓解幽门螺杆菌感染的临床症状,作为评估药物疗效、解析幽门螺杆菌耐药和根治失败的问题、引导临床选药是未来值得探索的课题,如唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)通过酸化环境可抑制幽门螺杆菌感染细胞诱导产生IL-8的降低及减少CagA蛋白的释放[20],提示是否可用生物机制即益生菌(probiotic bacteria)控制幽门螺杆菌感染引起的炎症反应。

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