熊果酸诱导人白血病HL－60细胞凋亡作用

赵洪昌，王 莹，赵文静

（1.长春急救中心，吉林 长 春130062；2.吉林省肝胆病医院）

熊果酸（Ursolic acid，UA），又名乌索酸，乌苏酸，是存在多种天然植物中的五环三萜类化合物，如白花蛇香草、山楂、女子贞、夏枯草等，熊果酸具有保护肝脏、降血脂、调节机体免疫、抗氧化和抗肿瘤等多种生物学活性［1，2］，研究表明熊果酸可通过诱导细胞凋亡抑制多种肿瘤细胞的生长，如人乳腺癌、胃癌、肺癌、淋巴瘤等［3－6］。关于熊果酸对人白血病HL－60细胞的增殖抑制作用、诱导凋亡作用及相关机制尚未见报道，本研究以HL－60细胞为研究对象，观察熊果酸对HL－60细胞的增殖抑制作用及诱导凋亡作用，并采用流式细胞术、Western blot技术研究熊果酸诱导HL－60细胞凋亡的分子机制，为熊果酸的开发利用提供实验基础和理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器

熊果酸为分析纯，纯度＞99.9%，购自天津市医药科学研究所；Annexin V－FITC／PI细胞凋亡检测试剂盒购自北京鼎国生物公司、Caspase－9／3蛋白活性检测试剂盒购自南京凯基生物公司；小鼠抗人Cyt－c、β－actin单克隆抗体美国 Santa Cruz公司，O－lympus荧光显微镜 （Olympus，Japan）；Beckman－XL流式细胞仪（Beckman，USA）。

1.2 方法

1.2.1 UA对HL－60细胞生长的抑制作用 参考文献［7］，MTT法测定熊果酸作用48 h对 HL－60细胞的增殖抑制作用（熊果酸的终浓度为5、10、20、30、40、50μmol／L）。抑制率（inhibition rate，IR）＝（对照组A值－实验组A值）／阴性对照组A值×100% ，并计算IC50值。

1.2.2 HL－60细胞丫啶橙（AO）荧光染色 参照文献［8］方法，不同浓度熊果酸作用48 h后收集HL－60细胞，A O染色，荧光显微镜下观察 HL－60细胞形态。

1.2.3 Annexin V－FITC／PI双染色法检测细胞凋亡 参照文献［9］方法，不同浓度熊果酸作用48 h后收集HL－60细胞，严格按照说明书进行操作，采用流式细胞仪测定HL－60细胞的凋亡情况率。

1.2.4 流式细胞仪检测HL－60细胞线粒体跨膜电位（△Ψm） 罗丹明123为带正电荷的荧光分子探针，具有高度亲脂性，当细胞用罗丹明123染色后，其主要分布在细胞内带负电荷的线粒体膜区，检测细胞内罗丹明123的荧光强度的强度可间接反映细胞的线粒体膜电位。参考文献［10］方法，流式细胞仪检测熊果酸作用6 h后的HL－60细胞线粒体膜电位。

1.2.5 Western Blot技术检测 HL－60细胞胞浆和线粒体中细胞色C含量的变化 按照参考文献［11］提取HL－60细胞胞质和线粒体部分裂解液，采用BCA试剂盒检测蛋白浓度。每组取50μg总蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜后将PVDF膜置于3%牛血清白蛋白内室温下封闭2 h，1∶1 000稀释的细胞色素C单克隆抗体4℃孵育过夜，PBS冲洗后，辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育2 h，DAB显色观察细胞色素C的表达，β－actin蛋白作为内参。

1.2.6 Caspase－3和 Caspase－9的活性检测 分光光度法检测Caspase－3和Caspase－9蛋白活性，收集各组细胞1×106个，按试剂盒说明书操作，测定A405值，以 A405 值 大 小 表 示 Caspase－3 和Caspase－9蛋白活性。该试剂盒的原理是将Caspase－3或Caspase－9蛋白特异性的多肽偶联至发色基团，当该底物被活化的Caspase－3（Caspase－9）剪切后，偶联的发色基团即游离出来，可通过分光光度计测定其吸光值，通过吸光度值的高低间接反映Caspase－3或Caspase－9蛋白的活性。

2 结果

2.1 熊果酸对HL－60细胞的增殖抑制作用

实验结果显示：对照组HL－60细胞生长活跃，经5、10、20、30、40、50μmol／L熊果酸作用48 h后，HL－60细胞生长明显受到抑制，并呈明显的剂量依赖性；各剂量组A570值与对照组A570值比较差异有统计学意义（P＜0.05），熊果酸作用 HL－60细胞48 h的IC50为21.5μmol／L。

2.2 熊果酸体外诱导HL－60细胞凋亡

AO染色后荧光显微镜下观察可见，对照组HL－60细胞核完整，呈均染绿色荧光，为正常细胞核的AO染色特征；HL－60细胞21.5μmol／L 熊果酸作用下，细胞体积缩小，部分细胞的细胞核碎裂、染色质凝集，表现为典型的凋亡细胞学形态特点（见图1）。同时本研究采用Annexin V－FITC／PI双染法定量检测凋亡率。21.5μmol／L熊果酸作用48小时后，HL－60细胞的早期凋亡率和晚期凋亡率分别为（28.96±6.28）%和（20.14±6.53）%，分别与对照组（0.11±0.06）%和（0.06±0.03）%比较差异有统计学意义（P＜0.05），研究结果提示熊果酸可诱导HL－60细胞凋亡（见图2）。

Fig.1 The apoptotic HL－60 cells treated with UA for 48 h（×400）

Fig.2 Apoptosis in HL－60 cells induced by UA for 48 h

2.3 熊果酸对 HL－60细胞线粒体膜电位和Caspase－3和 Caspase－9蛋白活性的影响

与对照组比较，熊果酸作用48 h后HL－60细胞线粒体膜电位降低，峰值明显左移，21.5μmol／L熊果酸组和阴性对照组低荧光部分细胞所占百分比逐渐降低，分别为（58.13±9.25）%和（2.98±1.03）%，差别有显著性（P＜0.05），见图3；21.5 μmol／L熊果酸作用下HL－60细胞胞质中细胞色素C的含量增加，相反，线粒体中的细胞色素C减少，见图4，结果表明熊果酸可能通过触发细胞色素C从线粒体释放入胞质，激活下游的凋亡通路。

Fig.3 The mitochondrial membrane potential of HL－6O cells treated with UA for 48 h

Fig.4 Cyt－c expression in cytosol and mitochondrial of HL－60 cells treated with UA for 48 h

对照组 HL－60细胞 Caspase－3、Caspase－9活性水平较低，A405值分别为（0.158±0.038）和（0.121±0.034）。在熊果酸作用下，Caspase－3、Caspase－9活性增加，21.5μmol／L 熊果酸作用48 h，A405值分别升至（0.425±0.083）和（0.382±0.074），与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），实验结果显示 熊 果 酸 作 用 下 HL－60细 胞 Caspase－3和Caspase－9蛋白被活化。

3 讨论

恶性肿瘤严重威胁人类健康。熊果酸可以诱导多种肿瘤细胞凋亡，尤其是可以诱导一些耐药肿瘤细胞株凋亡，研究还表明熊果酸对正常细胞毒性作用较小，具有高效低度的生物学特点，近年来熊果酸的抗肿瘤作用备受关注［3－6］。熊果酸具有多种生物学活性的特点，表明熊果酸可能是一个多靶点、多作用机制的药物，所以深入研究抗肿瘤作用和机制对新药的开发具有重要的意义。

诱导肿瘤细胞凋亡是多种抗肿瘤药物的主要作用机制，通过诱导凋亡消除肿瘤或抑制肿瘤生长已经成为癌症治疗的一种策略［12］。本研究结果表明熊果酸对HL－60细胞的增殖有较强的抑制作用，熊果酸体外可诱导HL－60细胞凋亡。研究表明，细胞凋亡途径主要有死亡受体途径和线粒体凋亡途径，线粒体凋亡途径首先是药物作用下，细胞线粒体膜电位下降，细胞线粒体膜电位的下降导致线粒体膜通透性增高，线粒体膜间腔的细胞色素c释放入胞浆，胞浆内细胞色素c可作为凋亡诱导因子，与凋亡蛋白酶活化因子1（Apaf－1）、caspase－9前体、ATP／d ATP结合形成凋亡体，凋亡小体进活化caspase－3，引发caspase级联反应，最终导致细胞凋亡［13］。本研究结果表明熊果酸作用下HL－60细胞线粒体膜电位明显降低，胞浆细胞色素增加，Caspase－9和Caspase－3蛋白活化，实验结果表明熊果酸启动细胞凋亡的线粒体体途径，诱导HL－60细胞凋亡。

综上所述，本研究观察了熊果酸 体外对HL－60细胞的增殖抑制作用，观察到熊果酸可以诱导HL－60细胞凋亡，通过检测线粒体膜电位、细胞色素C和caspase－9、3蛋白活性，表明熊果酸通过线粒体体凋亡途径，启动和介导了HL－60细胞的凋亡过程。

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