急性脑梗死血小板活化状态的检测及临床意义

胡 瑛 朱蓝玉 张 冬 于增国▲

1.解放军第二一○医院检验科，辽宁大连 116021；2.大连大学医学院检验系，辽宁大连 116622；3.大连市中医医院检验科，辽宁大连 116000

急性脑梗死血小板活化状态的检测及临床意义

胡 瑛1朱蓝玉2张 冬3于增国2▲

1.解放军第二一○医院检验科，辽宁大连 116021；2.大连大学医学院检验系，辽宁大连 116622；3.大连市中医医院检验科，辽宁大连 116000

目的 探讨急性脑梗死发病不同时期中血小板的活化状态以及各项检测指标的相互关系与临床意义。 方法 采用FCM测定52例脑梗死患者发病的急性期（发病1～3 d）和稳定期（治疗的10～14 d）血小板CD62p和CD63表达率，用玻球法测定PAdT，智能血液凝集仪测定PAgT，同时检测正常对照组30例。 结果 脑梗死急性期CD62p和CD63表达率较稳定期及正常对照组显著上调（P＜0.01）；待病情稳定时两者表达均明显下降，但亦较正常对照组增高（P＜0.01），且CD62p和CD63表达呈著正相关（r=0.788，P=0.003）；PAdT和PAgT在脑梗死急性期亦较正常对照组显著升高（P＜0.01），稳定期则降至正常水平。 结论 CD62p、CD63的表达与PAdT、PAgT随脑梗死病情演变而变化，两者呈一致性，共同参与脑梗死发生、发展病理过程；CD62p、CD63表达比PAdT、PAgT能更加敏感而准确地反映出血小板活化状态，且具有较高的一致性，可作为ACI诊断、病情监测及判断预后的重要指标之一。

脑梗死；P-选择素；溶酶体蛋白；血小板粘附率；血小板聚集率

急性脑梗死（ACI）是一种严重危害中老年人健康的缺血性脑损害性疾病。本病病因病机十分复杂，有研究表明，血小板的高活化状态在脑梗死形成过程中具有重要作用，是发生ACI重要危险因素之一[1-2]。为此，本研究拟通过对52例ACI患者发病不同时程的血小板黏附率（PAdT）、血小板聚集率（PAgT）和血小板P-选择素（CD62P）、溶酶体蛋白（CD63）表达率的检测，进一步研究脑梗死发病过程中血小板的活化状态，明确血小板各项活化功能检测指标的相互关系与临床应用价值，为深入研究ACI发病机制和建立实验室诊断敏感指标提供科学的依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象

脑梗死组：为2011年4月～2011年12月间笔者所在医院神经内科住院的脑梗死患者52例，其中男28例，女24例；年龄51～82 岁，平均（63.3±12.3）岁；临床诊断符合全国第五届脑血管病学术会议修订的标准，神经功能缺损程度评分（NDS）：轻型16例，中型28例，重型8例。排除肝肾疾病、肿瘤、感染、自身免疫性疾病和代谢性疾病。发病前2周内未服过阿斯匹林、潘生丁等影响血小板功能的药物和其他抗凝药物。

正常对照组：系30名来自笔者所在医院同期健康体检者，排除冠心病、高血压、糖尿病史等，与脑梗死组在性别、年龄上比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 主要试剂与仪器

1.2.1 主要试剂 单克隆抗体CD62p-FITC、CD63-PE、IgG1-FITC、IgG1- PE，均购自法国Immunotech公司。

1.2.2 主要仪器 流式细胞仪（EPICS-XL型，美国Coulter公司）、血小板粘附仪（中国医学科学院血研究所产品）、血小板聚集仪（PEA3200型，日本科学株式会社产品）。

1.3 方法

1.3.1 采血时间与标本制备 全部患者于发病的急性期（1～3 d）及稳定期（治疗的10～14 d）分别清晨空腹抽取静脉血，用106 mmol/L枸缘酸钠抗凝（血与抗凝剂比9∶1），以800 r/min离心5 min，取富含血小板血浆（PRP），用于CD62p与CD63测定。

1.3.2 CD62p与CD63测定 取200μL PRP以等体积2%甲醛固定，再用磷酸缓冲液（PBS）洗涤2～3次，调整血小板浓度为300×109/L，分别加入CD62p、CD63荧光单抗避光室温混匀孵育30 min，然后用PBS洗涤1次后，加入0.5 mL PBS重悬，采用流式细胞仪进行检测。测定中用CD41/sslog散点图设门，流速控制在100～200 s，每份标本测定5 000～10 000个血小板[3]。

1.3.3 PAdT测定 采用玻璃球旋转法[4]。清晨空腹抽取患者肘静脉血3.6 mL，以106 mmol/L枸缘酸钠1∶9抗凝，摇匀后取1.0 mL加入血小板粘附仪中进行检测。

1.3.4 PAgT测定 采用比浊法[4]。空腹状态下抽取患者肘静脉血，抗凝后注入特制的硅化试管中，离心、制备PRP和PPP血浆，取0.5 mL PRP置于血小板聚集仪比浊管内，由微机自动处理并记录血小板聚集曲线，报告5 min血小板最大聚集率。

1.4 统计学处理

运用统计软件SPSS11.5，数据采用方差分析进行比较，以（± s）表示，以P＜0.05为差异有统计学意义。相关分析采用直线相关分析（当P＜0.01时为正相关）。

2 结果

2.1 脑梗死组与正常对照组PAdT与PAgT的比较

检测结果显示，脑梗死组急性期（1～3 d）PAdT、PAgT较正常对照组显著升高（P＜0.01）；而稳定期（10～14 d）则降至正常水平。见表1。

表1 脑梗死患者不同时程PAdT、PAgT的变化比较（± s）

表1 脑梗死患者不同时程PAdT、PAgT的变化比较（± s）

注：与正常对照组比较，*P＜0.01

组别 n PAdT（%） PAgT（%）脑梗死组（1～3 d） 52 60.12±11.50* 71.20±16.80*脑梗死组（10～14 d） 52 43.20±7.90 48.30±12.10正常对照组 30 41.70±8.59 49.75±18.98

2.2 脑梗死组与正常对照组CD62p、CD63表达率的比较

脑梗死组急性期CD62p、CD63表达率较正常对照组显著上调（P＜0.01）；稳定期二者表达率较急性期明显下降（P＜0.01），但仍较正常对照组增高（P＜0.01）。见表2。

表2 脑梗死患者不同时程CD62p、CD63表达率的比较（± s）

表2 脑梗死患者不同时程CD62p、CD63表达率的比较（± s）

注：与对照组比较，*P＜0.01；与稳定期比较，**P＜0.01

组别 n CD62p（%） CD63（%）脑梗死组（1～3 d） 52 9.01±1.69* 8.15±1.21*脑梗死组（10～14 d） 52 5.12±1.18** 4.03±1.15**正常对照组 30 1.48±0.46 0.89±0.41

2.3 血小板CD62p与CD63表达的相关性分析

经采用直线相关分析，结果显示脑梗死组血小板CD62p与CD63的表达二者呈显著正相关（r=0.788，P=0.003）。

3 讨论

近年来，随着“血栓与止血”研究的不断深入，使血小板在多个系统疾病的病理生理作用机制不断被发现，为许多生命现象与病理过程增加了新的认识，尤其是血小板高活化状态在缺血性脑损害过程中所起的作用，以及活化血小板的各项检测指标相互关系及其应用评价，始终是研究的热点之一。

众所周知，血小板粘附功能和聚集功能是活化后血小板所表现出的两大主要生理功能，是血小板进一步活化、参与止血、促进血液凝固的保证，也是血栓形成的重要基础。早年，临床上通常采用PAdT和PAgT作为血小板活化功能主要指标，已有诸多报道在脑梗死形成时活化的血小板粘附性和聚集性均明显增高。本研究检测结果亦显示，脑梗死急性期，患者的PAdT和PAgT均较正常对照组显著升高（P＜0.01），而稳定期二者则降至正常水平，表明在脑梗死急性期体内存在高凝状态和血小板的高度活化，这与刘姣[2]报道一致。

近年来，随着血小板功能检测技术的不断进步，血小板的活化程度亦可采用血小板膜蛋白表达高低来判断[5]。其中，最主要的是存在于血小板胞质内颗粒膜糖蛋白CD62p和CD63。CD62p为血小板α颗粒膜糖蛋白，亦称P-选择素；CD63是溶酶体颗粒糖蛋白53，又称血小板溶酶体蛋白[6]。当血小板活化时，存在于血小板胞质内的CD62p和CD63被迅速动员到细胞表面，介导并启动血小板与白细胞、内皮细胞粘附，引起血栓并加剧脑组织损伤。因此，CD62p、CD63成为检测血小板活化程度及血栓形成可靠而特异的标志物[7-8]。本研究检测结果显示，在脑梗死发病急性期CD62p与CD63表达均较对正常照组显著上调（P＜0.01），表明此时血小板功能异常活跃并处于高度活化状态，直接参与脑梗死病理过程的早期阶段。当治疗的第10～14天，病情处于稳定期时，CD62p与CD63的表达则明显下降（P＜0.01），说明CD62p与CD63的表达水平是随着脑梗死病情演变过程而呈动态变化。但仍较正常对照组高（P＜0.01），可能系脑梗死尚未完全恢复血小板仍处于功能活跃状态以及CD62p与CD63表达下降较为缓慢之故[9]。经相关性分析显示CD62p与CD63表达呈显著直线正相关（r=0.788，P=0.003）。因此，两者的表达不但与脑梗死病情演变密切关联，并且具有较高的一致性。

值得注意的是，通过本研究检测结果分析还发现，在脑梗死发病的急性期，PAdT、PAgT随着CD62p与CD63表达上调而显著增高，说明血小板的粘附功能和聚集功能与活化血小板胞质内颗粒膜糖蛋白表达是一致性。段金海等[10]研究证明，CD62p不仅对血小板粘附起促进作用，并且对血小板聚集也具有重要作用。而在脑梗死稳定期时，虽然CD62p与CD63表达仍高于正常对照组（P＜0.01），但PAdT、PAgT却已降到正常水平，从而证明在脑梗死稳定期时CD62p与CD63表达和PAdT、PAgT并不一致，提示PAdT、PAgT尚不能完全准确地反映血小板活化状态。因此，CD62p与CD63表达比PAdT、PAgT能更准确地反映出脑梗死的病情变化与程度[11-12]。

总之，通过本研究检测与分析，表明在脑梗死发病过程中体内存在着血小板高度活化，并通过各种效应直接参与缺血性脑损伤的发生、发展和转归过程，是ACI发生的重要危险因素。血小板CD62p与CD63表达的检测较比PAdT、PAgT能更加敏感的反映出体内血小板活化状况，从而准确提示缺血性脑血管病的病理变化，对ACI临床早期诊断、预防和治疗、预测病情演变及指导临床用药均有重要意义。

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The detection of the platelet activation status of the acute cerebral infarction and its clinical significance

HU Ying1ZHU Lanyu2ZHANG Dong3YU Zengguo2
1.Department of Laboratory, the 210th Hospital of People's Liberation Army,Dalian 116021,China;2.Department of Laboratory,Dalian University of Medicine, Dalian 116622,China; 3. Department of Laboratory, Dalian City Chinese Medicine Hospital, Dalian 116000,China

ObjectiveThis article studies on the platelet activation status during the different phases of acute cerebral infarction and the relationship of indicators in various detections and tells us the clinic significance of the research.MethodsDetermining the expression level of the p-selectin(CD62P)and lysosome membrane protein(CD63)of platelet by FCM during the acute phase(1～3 d after the occurrence)and the stable phase(10～14 d of the treatment)of 52 cases of cerebral infarction,determining the PAdT by glass ball method, and determining the PagT by intelligent blood coagulation instrument and meanwhile detect 30 cases of normal control group.ResultsIn the acute phase of cerebral infarction,the expression level of CD62p and CD63 was significantly higher(P＜0.01)than that of the stable phase and the normal control group.When the conditions of patients were stable,the expression level of CD62p and CD63 was significantly decreased but still higher than the normal control group(P＜0.01),and the expression level of CD62p was obviously positively correlated with that of CD63(r=0.788，P=0.003).In the acute phase of cerebral infarction,PAdT and PagT were both significantly increased than that of the normal control group,but they return to normal level when the illness comes to the stable phase.ConclusionCD62p and CD63,PAdT and PAgT change with the progression of cerebral infarction and show great correspondence,and they all involve in the occurrence and development process of pathogenesis of cerebral infarction.The expression level of CD62p and CD63 with higher consistent was more sensitive and accurate than PAdT and PAgT in reflecting the platelet activation status,it can be used as an important indicator for ACI diagnosis,observation of the disease course and prediction of the prognosis.

Cerebral infarction;P-selectin;Lysosomal membrane protein53;PAdT and PAgT

R446.11+2

A

2095-0616（2012）12-108-03

▲通讯作者

2012-04-25）