福氏志贺菌ipaB基因的克隆及序列测定

王国富，白 丽，薛士鹏，吴利先

（大理学院基础医学院，云南大理 671000）

福氏志贺菌ipaB基因的克隆及序列测定

王国富，白 丽，薛士鹏，吴利先*

（大理学院基础医学院，云南大理 671000）

目的：克隆福氏志贺菌（Shigella flexneri，S.flexne）的ipaB基因。方法：以福氏志贺菌2a 2457T（Nal）r为模板，用PCR扩增ipaB目的基因片段，克隆至pQE-30表达载体中，构建含目的基因的表达质粒pQE-ipaB。结果：构建了重组质粒pQE-ipaB，ipaB基因全长1 743 bp，经测序分析与预期相符。结论：成功克隆了ipaB基因。

福氏志贺菌；ipaB基因；克隆；测定；一致

志贺氏菌引起的细菌性痢疾为一种全球性的肠道传染病。据估计，全世界每年感染的人数超过两亿，由该病引起的死亡人数有65万左右〔1〕。福氏志贺菌（Shigella flexneri，S.flexneri）是细菌性痢疾的重要致病菌之一〔2〕。细菌性痢疾的发生开始于细菌侵入肠上皮细胞，引起局部细胞的坏死和炎症反应。目前研究认为，细菌性痢疾的发病机制主要与志贺菌的毒力质粒有关，消除该质粒后志贺菌的致病力也随之消失：毒力质粒上一个31 kb大小的片断是细菌侵袭所必需的，编码多种与侵袭相关的基因：其中由它编码合成的侵袭质粒抗原（Ipa）A，B，C，D是志贺菌侵入肠上皮细胞所必需的〔3-4〕。目前认为，在菌体外，IpaB和IpaC蛋白以复合物形式存在，从而介导志贺菌侵入肠上皮细胞〔5-6〕。所以，本实验选择其中一个与志贺菌毒力明显相关的基因ipaB为靶基因，从福氏志贺菌2a 2457T（Nal）r菌株进行克隆，克隆了ipaB，为进一行研究IpaB的表达和志贺菌发病机制的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 福氏志贺菌2a 2457T（Nal）r由军事医学科学院生物工程研究所王恒梁博士惠赠。原核表达载体pQE-30质粒为大理学院基础医学院微生物学教研室保存。限制性内切酶、T4DNA连接酶（快速连接试剂盒）、KpnI、SalI、PCR纯化试剂盒为Takara Bio公司产品，DNA胶回收试剂盒购自Tian gen公司。高保真Tag DNA聚合酶、dNTP购自北京晨绿公司。

1.2 菌株培养 将福氏志贺菌2a 2457T（Nal）r接种在含0.025%刚果红和40 μg/mL萘啶酮酸（Nal）的水解大豆琼脂（Tryptiscase soy agar，TSA）平皿上划线培养，挑取红色菌落接种于水解大豆肉汤（Tryptiscase soy broth，TSB）培养基在37℃140转摇床培养备用。

1.3 基因的扩增 取TBS培养过夜的福氏志贺菌2a 2457T（Nal）r50 uL，12000转5 min离心弃上清液后加50 uL去离子水，煮沸10 min，12 000转离心5 min，取上清液2 uL作为PCR模板，反应体系中加入dNTP 4 μL，10×PCR buffer缓冲液5 μL，Mg2+4 μL，TagDNA聚合酶1 uL，引物P1、P2各1 μL，补水至50 μL。反应条件为:95℃4 min后，按下列参数扩增30个循环，即94℃变性60 s，52℃退火60 s，72℃延伸60 s，30个循环后72℃再延伸8 min。

1.4 重组质粒的构建 PCR扩增片段经1%琼脂糖凝胶70 V、50 mA电泳，在荧光灯下将扩增片段条带切下，用北京Tian gen DNA胶回收试剂盒回收目的片段，质粒pQE-30和目的基因经KpnI和SalI双酶切，用PCR纯化试剂盒回收酶切片段，用T4DNA连接酶试剂盒在16℃连接4 h，转化到TOP-10宿主菌，双酶切鉴定筛选出阳性克隆。挑取阳性克隆接种于LA（含Amp 100 mg/L）液体培养基中，增菌备用。

1.5 序列测定 取鉴定后筛选出的阳性克隆重组质粒送往北京晨绿公司进行测序。

2 结果

2.1 ipaB基因的PCR扩增产物 根据基因文库中的ipaB基因序列设计引物如下P1:5′-CC GGTACC ATG AAA GCA AAT AAT C-3′P2:5′-CC GTCGAC TTA TCG GTT TCT-3′由上海生工公司合成。P1引入内切酶KpnI的酶切位点，P2引入内切酶SalI的酶切位点。ipaB基因全长1 711 bp，其PCR结果见图1。

图1 ipaB PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果

2.2 重组表达质粒的鉴定 重组质粒pQE-ipaB经 KpnI、SalI双酶切鉴定结果见图2，能切出与ipaB大小相符的片段（1711bp），表明基因克隆成功。

图2 重组质粒pQE30-ipaB的鉴定

2.3 重组质粒pQE-ipaB的序列分析 利用pQE-30的通用引物，由北京晨绿公司进行测序后进行序列分析。测序结果与文献〔3〕报道一致，见图3。

图3 ipaB基因的序列图谱

3 讨论

存在于志贺菌中214 Kb大小的毒力质粒上的一个大小为31 kb大小的编码Ipa/mxi-spa蛋白的致密基因被认为是志贺菌的毒力岛（PAI）。PAI编码着与侵袭相关的多数基因，其中侵袭性相关基因（Ipa）B，C，D是重要组成成分之一〔7-8〕。志贺菌致病的第一步是侵入肠上皮细胞，毒力质粒上位于同一转录单位的ipaBCD的表达产物IpaBCD为志贺菌侵入上皮细胞所必需的。其中，IpaC与IpaB形成可溶性复合物IpaB-IpaC。IpaB-IpaC复合物可能与位于上皮细胞基底面整合素α5β1结合，诱发靶细胞内蛋白激酶活性改变，发生信号级联放大作用，从而介导志贺菌的入侵〔9-10〕。所以，IpaB在志贺菌入侵肠上皮细胞中的作用很重要，有必要对其进行深入研究。

本实验选择福氏志贺菌毒力质粒上编码的侵袭蛋白基因ipaB作为研究对象，并成功地将该基因扩增、克隆到原核表达质粒pQE-30中，构建了pQE-ipaB重组质粒，这将为进一步研究IpaB的表达及免疫学功能，以及研究细菌性痢疾的发病机制提供依据。

〔1〕Kotloff K L，Winickoff J P，Ivanoff B，et al.Global burden of Shigella infections:implications for vaccine development and implementation of control strategies〔J〕. Bull World Health Organ，1999，77:651-661.

〔2〕王国富，白丽.志贺菌的致病机制研究进展〔J〕.国际流行病学传染病学杂志.2011，38（2）：137-139.

〔3〕Menard R，Dehio C，Sansonetti PJ.Bacterial entery into epithelial cells:the paradigm of Shigellosis〔J〕.Trends Microbiol，1996，4（6）:220-226.

〔4〕薛世鹏，王国富，吴利先.志贺菌的疫苗研究进展〔J〕.中国热带医学，2011，11（9）：1167-1169.

〔5〕Sasakawa C，Kamata K，sakai T，et a1.Virulence-assosiated genetic regions comprising 31 kilobases of the 230.kilobaseplamaid in Shigella flexneri 2a〔J〕.J Bacteriol， 1998（170）：2480-2484.

〔6〕Menard R，Dehio C，Sansonetti P J.Bacterial entery into epithelial cells：the paradigm of Shigellosis〔J〕.Trends Microbiol，1996（4）:220-226.

〔7〕Hamiaux C，Van EA，Parsot C，et al.Structural mimicry for vinculin activation by IpaA，a virulence factor of Shigella flexneri〔J〕.EMBO Rep，2006，7（8）:794-799.

〔8〕Schroeder GN，Hilbi H.Molecular pathogenesis of Shigella spp.:controlling host cell signaling，invasion，and death by type III secretion〔J〕.Clin Microbiol Rev，2008，21（1）:134-156.

〔9〕Sani M，Botteaux A，Parsot C，et al.IpaD is localized at the tip of the Shigella flexneri type III secretion apparatus〔J〕.Biochim Biophys Acta，2007，1770（2）:307-311.

〔10〕Ramarao N，Le CC，Izard T，et al.Capping of actin filaments by vinculin activated by the Shigella IpaA carboxyl-terminal domain〔J〕.FEBS Lett，2007，581（5）: 853-857.

Cloning and Sequencing of IpaB Gene of Shigella flexneri

WANG Guofu,BAI Li,XUE Shipeng,WU Lixian*
（Pre-clinical College,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective：To clone and sequence of ipaB gene of Shigella flexneri.Methods：IpaB gene was amplified by PCR.The DNA products of ipaB were inserted into a prokaryotic expression vector pQE-30,and then translated into E.coli strain Top10,restriction digestion and sequencing.Results：The recombinant plasmid was constructed and ipaB gene was sequenced as 1 743 bp,conformity with expectation.Conclusion：The results indicated that recombinant plasmid was constructed successfully.

Shigella flexneri；ipaB gene；cloning；assay;conformity

R373［文献标志码］A［文章编号］1672-2345（2012）03-0028-03

云南省教育厅科研基金重点资助项目（2009z0078）

2011-12-05

王国富，副教授，主要从事医学微生物与免疫学研究.

*通信作者：吴利先，教授.

（责任编辑 董 杰）