薄荷醇合成关键酶基因的克隆

韩 瑞，王贤磊，高兴旺，钟 俐

(新疆大学，生命科学与技术学院，新疆乌鲁木齐830046)

薄荷醇合成关键酶基因的克隆

韩 瑞，王贤磊，高兴旺，钟 俐*

(新疆大学，生命科学与技术学院，新疆乌鲁木齐830046)

采用Trizol法从12℃处理48h的10d龄薄荷叶片中提取总RNA，通过RT－PCR方法扩增获得薄荷醇合成关键酶基因cDNA(命名为LT，ST)，连接到pMD18－T载体上，命名为pMD18－T－LT，pMD18－T－ST。结果表明:扩增的薄荷醇合成酶片段全长约1125bp和942bp。将获得的基因成功构建到植物表达载体pCAMBIA1301上，经转化根癌农杆菌GV3101，经菌落PCR进一步鉴定转化结果。实验结果为进一步从分子水平挖掘并利用薄荷醇合成酶关键基因奠定基础。

薄荷，薄荷醇合成酶，基因克隆

1 材料与方法

1.1 实验材料

薄荷(M.haplocalyx Briq) 由中国工程院吴明珠院士提供;大肠杆菌 DH5α，植物表达载体pCAMBIA1301，根癌农杆菌 GV3101;Trizol，DEPC，Hygromycin，PCR相关试剂;引物 由Takara公司合成;反转录试剂盒，DNA凝胶回收试剂盒，pMD18－T vector试剂盒，限制性内切酶Sal I，Sam I，T4DNA连接酶，PCR引物;YEB固体培养基 含50mg/L Kan，50mg/L Rif，50mg/L Gen。

1.2 实验方法

1.2.1 薄荷醇合成关键酶基因的克隆

1.2.1.1 植物材料的处理 取适量干燥的薄荷种子在超净工作台中加入75%的乙醇浸泡10min，用灭菌蒸馏水漂洗播布于MS固体培养基，4℃纯化7d后移至光照培养箱中进行光照培养，培养条件为:光照16h，25℃/黑暗8h，19℃;待长出2片真叶，移栽到蛭石/珍珠岩≈3∶1培养基质中光照培养。

1.2.1.2 总RNA的提取 采用Trizol法［14］提取薄荷总RNA，保存于－80℃冰箱待用。

1.2.1.3 cDNA的合成 取11μL RNA为模板，加入相应的试剂与引物，反转录条件:42℃，60min;70℃，10min，冰上冷却，合成cDNA第一链。以反转录产物为模板进行PCR扩增目的cDNA的第二条链，PCR反应条件:(LT)94℃，5min;94℃，30s;40℃，40s; 72℃，60s;72℃，7min，35循环;(ST)94℃，5min; 94℃，30s;50℃，40s;72℃，60s;72℃，7min，35循环。1.2.1.4 引物设计 以Genbank中公布的薄荷醇合成关键酶基因序列为模板，用Primer Premier 5软件设计特异引物。

引物 LT－1序列为:ATGGCTCTAAAGTGTT AAGTGG;引物LT－2序列为:TCATGCAAAGGGC TCGAATA;引物ST－1序列为:ATGGCCATTAATCTC TCCCATA;引物 ST－2序列为:CTAAGCCGCG TAAAGGCTCG。

引物用时先4000r/min离心2min，然后按照引物单上说明加相应体积 ddH2O稀释成10μmol/L，－20℃贮存备用。

1.2.1.5 RT－PCR产物的纯化和克隆测序 经琼脂糖凝胶电泳检测的RT－PCR产物，采用DNA凝胶回收试剂盒进行回收。纯化的PCR产物在T4DNA连接酶的作用下3000r/min离心10s，置4℃冰箱过夜反应。连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，Amp浓度100mg/L，菌落PCR法筛选阳性克隆，并用SDS碱裂解法小量提取质粒进行鉴定。将重组质粒pMD18－T－LT，pMD18－T－ST的菌液送北京华大生物工程有限公司测序。

1.2.2 植物表达载体的构建［15－17］SDS碱裂解法中量制备载体pCAMBIA1301，用SalI和SamI进行双酶切质粒 pMD18－T－LT，pMD18－T－ST及载体pCAMBIA1301并回收。将回收的目的条带用 T4DNA ligase于 16℃ 过夜连接，得到重组质粒pCAMBIA1301－LT，pCAMBIA1301－ST。

1.2.3 重组质粒的鉴定 重组质粒pCAMBIA1301－LT，pCAMBIA1301－ST的转化同1.2.1.5，不同之处是将Amp改为Kan，且Kan终浓度为50mg/L;采用菌落PCR鉴定和双酶切鉴定的方法筛选阳性单克隆，阳性菌液加20%灭菌甘油后于－70℃冰箱保存。

1.2.4 转化根癌农杆菌 SDS碱裂解法小量制备重组质粒pCAMBIA1301－LT，pCAMBIA1301－ST，制备根癌农杆菌GV3101感受态细胞，采用反复冻融法将提取的重组质粒pCAMBIA1301－LT，pCAMBIA1301－ST转化至制备好的根癌农杆菌GV3101感受态细胞中。将根癌农杆菌 GV3101菌株(携带有pCAMBIA1301－LT，pCAMBIA1301－ST)接种到YEB固体培养基，28℃黑暗培养2d。

1.2.5 筛选鉴定阳性克隆 采用菌落PCR鉴定和质粒鉴定的方法筛选阳性单克隆。挑取单克隆接种于YEB液体培养基，28℃、220r/min避光振荡培养约48h;振荡培养至OD600为0.5左右，SDS碱裂解法小量制备重组质粒，进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，鉴定无误后将阳性菌液加20%灭菌甘油后于－70℃冰箱保存。

2 结果与分析

2.1 薄荷醇合成关键酶基因克隆

2.1.1 总RNA的提取 经 Trizol法提取总RNA，0.7%琼脂糖电泳检测(图1)，条带清晰整齐，无降解，所得RNA完整，可以进行反转录。

图1 薄荷总RNAFig.1 Total RNA of peppermint

2.1.2 薄荷醇合成关键酶基因克隆及回收的结果利用设计的特异引物经35个循环RT－PCR扩增，获得了大约为1140bp和960bp的片段，目的条带单一，特异性强(图2)。PCR扩增产物经片段回收，在T4DNA连接酶的作用下连接并转化E.coli DH5α感受态细胞。

图2 薄荷醇合成酶关键基因RT－PCR扩增结果Fig.2 Menthol capital synthase gene amplified by RT－PCR

2.1.3 薄荷醇合成关键酶基因的序列分析 经双向测序后拼接，获得薄荷醇合成关键酶基因序列全长，基因LT和ST全长分别为1125bp和942bp，编码375个和313个氨基酸。用DNAMAN软件分析得出:两对基因分别达到97.33%和100%的同源性。

2.2 植物表达载体的构建

2.2.1 重组质粒pMD18－T－LT、pMD18－T－ST与载体pCAMBIA1301酶切并回收 采用 SDS碱裂解法［8］中量制备重组质粒pMD18－T－LT、pMD18－T－ST和载体质粒pCAMBIA1301，经SalI和SamI双酶切后，大小与预计相符，说明质粒 pMD18－T－LT、pMD18－T－ST已切开(图3)。

图3 SalI和SamI双酶切鉴定重组质粒Fig.3 Recombinant plasmid digested by SalI and SamI

2.2.2 重组质粒pCAMBIA1301－LT、pCAMBIA1301－ ST的鉴定 以薄荷醇合成酶关键基因引物LT－1/LT－2、ST－1/ST－2进行菌落PCR后电泳显示，条带大小相符，且亮度高，初步说明薄荷醇合成酶关键基因已成功连接到表达载体pCAMBIA1301上(图4)。小提重组质粒用SalI和SamI进行双酶切，电泳成像后显示出两条带，且大小与预计相符，从而进一步证明薄荷醇合成酶关键基因已成功连接到表达载体pCAMBIA1301上(图5)。

图4 菌落PCR鉴定重组质粒Fig.4 Recombinant plasmid identified by PCR

图5 双酶切鉴定重组质粒Fig.5 Recombinant plasmid digested

2.2.3 重组质粒pCAMBIA1301－LT、pCAMBIA1301－ST转化根癌农杆菌鉴定 小量制备重组质粒pCAMBIA1301－LT、pCAMBIA1301－ST，条带大小相符，且亮度高，说明质粒浓度较高(图6)。以薄荷醇合成酶关键基因引物LT－1/LT－2、ST－1/ST－2进行菌落PCR后电泳显示，条带大小相符，且亮度高，说明薄荷醇合成酶关键基因已转化到根癌农杆菌GV3101中(图7)。

图6 质粒鉴定Fig.6 Plasmid identified by PCR

3 结论

实验采用Trizol法从12℃处理48h的10d薄荷叶片中提取总RNA，利用RT－PCR技术，克隆得两对薄荷醇合成关键酶基因，与Genbank中的薄荷醇合成关键酶基因相比对，核苷酸的同源性分别为97.33%和 100%。并成功构建到植物表达载体pCAMBIA1301上，经转化根癌农杆菌，经菌落PCR和质粒进一步鉴定转化结果。

图7 菌落PCR鉴定Fig.7 Plasmid digested

目前食品风味的改善及风味物质的生产，已成为广大食品研究者和生产者关注的热点。对风味酶的深入研究是食品生物化学的一项重要任务。利用生物技术生产的风味物质天然风味醇厚且不受原料、地区限制，克服了从动植物中天然提取的困难，而且用生物转化法生产的风味酶被美国和欧盟认为是天然产物，国内在此方面的研究和应用刚起步。

甜瓜是新疆重要的特色经济作物。新疆甜瓜以其特有的优良风味和品质享誉国内外［19］。但甜瓜生产缺乏具有特色的新型品种，局限于原始的种植资源加之传统的栽培育种技术周期长［18］。薄荷醇作为一种独特的风味酶，利用风味酶在食品风味的再现、强化和改变方面的应用，并使用分子标记、分子克隆和转基因等技术，转基因技术将成为改善甜瓜种质的一个重要方法。利用分子克隆技术或人工改造和合成具有某一特性的基因(如薄荷醇合成关键酶基因)，转移到供体甜瓜中去，就可获得前所未有的、利用常规育种难以获得的新种质，为甜瓜育种开辟新的道路，也为应用遗传转化手段获得新基因培育特色风味甜瓜新品种奠定良好的基础。

［1］米吉提·胡达拜尔地，徐建国.新疆高等植物检索表［M］.乌鲁木齐:新疆大学出版社，2000:470.

［2］张秋燕.薄荷的食疗功效［J］.中国食物与营养，2005，20 (4):28.

［3］章思规.精细有机化学品技术手册(下)［M］.北京:科学出版社，1993:1230.

［4］Mark R Wildung，Rodney B Croteau.Genetic engineering of peppermint for improved essential oil composition and yield［J］. Transgenic Research，2005，14(4):365－372.

［5］刘俊花，葛玉，张宝善.食品风味酶的研究进展［J］.中国酿造，2005(2):6－8.

［6］Alessandra Carrubba，Caterina Catalano.Essential oil crops for sustainable agriculture［J］.Climate Change，Intercropping，Pest Control and Beneficial Microorganisms，2009(2):137－187.

［7］Laule O，Furholz A，Chang HS，et al.Crosstalkbetween cytosolic and plastidial pathways of isoprenoid biosynthesis in arabidopsis thaliana［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2003，100:6866－6871.

［8］RodneyB，Croteau，EdwardM Davis，etal.(－)－ Menthol biosynthesis and molecular genetics［J］ . Naturwissenschaften，2005，92(12):562－577.

［9］徐应文，吕季娟，吴卫.植物单萜合酶研究进展［J］.生态学报，2009，29(6):3188－3197.

［10］罗永明，刘爱华，李琴.植物萜类化合物的生物合成途径及其关键酶的研究进展［J］.江西中医学院学报，2003，15(1): 45－51.

［11］罗永明，刘爱华，李琴.植物萜类化合物的生物合成途径及其关键酶的研究进展(续)［J］.江西中医学院学报，2003，15 (2):46－49.

［12］李莉，高凌云，董越，等.植物类异戊二烯生物合成相关酶基因研究进展［J］.浙江师范大学学报:自然科学版，2008，31 (4):461－466.

［13］陈建，赵德刚.植物萜类生物合成相关酶类及其编码基因的研究进展［J］.分子植物育种，2004，2(6):757－764.

［14］萨姆布鲁克D W拉塞尔.分子克隆实验指南［M］.黄培堂等译.北京:科学出版社，2002:26－644.

［15］赵宝杰，侯夫云，王庆美，等.甘薯二羟基黄酮醇还原酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达［J］.分子植物育种，2008，6 (3):583－588.

［16］崔红，郭小玲，时向东，等.法呢基焦磷酸合酶基因的克隆及双元载体的构建［J］.厦门大学学报:自然科学版，2004，43 (2):253－255.

［17］Edward M Davis，Kerry L Ringer，Marie E，et al.Cloning，expression，and characterization of menthone reductases from peppermint［J］.Plant Physiology，2005，137:873－881.

［18］吴明珠冯炯鑫，伊鸿平，等.厚皮甜瓜设施栽培经济实用高效技术探讨［J］.中国瓜菜，2006(3):32－34.

［19］刘君璞，俞正旺，马跃.中国西瓜甜瓜的发展回顾［J］.中国西瓜甜瓜，2000(1):4－8.

Clone of menthol capital synthase gene

HAN Rui，WANG Xian－lei，GAO Xing－wang，ZHONG Li*
(College of Life Science and Technology，Xinjiang University，Urumqi 830046，China)

The method of Trizol was extracted to the total RNA from 10th day peppermint leaf which was processed about 48h under 12℃，RT－PCR was employed to clone cDNA fragment of menthol synzyme gene(named for LT，ST).The purpose fragments named pMD18－T－LT、pMD18－T－ST which were connected on the pMD18－T vector. The result indicated:Sequence length of LT and ST were about 1125bp and 942bp.The coloned genes were introduced into the plant expression vector pCAMBIA1301 and transformed into Agrobacterium tumefaciens GV3101.Colony PCR was employed to evaluate transformation result.The study provided material for further exploring menthol synzyme gene in molecular level.

peppermint;menthol synthase;gene cloning

Q785

A

1002－0306(2012)08－0239－04

薄荷为唇形科薄荷属植物(M.haplocalyx Briq)［1］，是一种多年生草本植物，有特异芳香气味，具宜风退热、解郁疏气、祛风止痒、健胃止痛等作用［2］。薄荷醇，俗名薄荷脑，学名5－甲基－2－异丙基－环己醇，是重要的单环萜醇。左旋薄荷醇具有薄荷香气和清凉作用，消旋薄荷醇也有清凉作用，其它异构体无清凉作用［3］。薄荷醇作为一种重要香原料和传统的清凉剂，在医药卫生方面的应用比例较大，如使心血管舒张、抑止呼吸、止咳、辅助消化、解心情急躁综合症等功效，其次用于香料如烟草香料［4］、牙膏香精、花露水等，还可以作为多种食品的调味剂。薄荷醇合成关键酶(GPP合成酶)为萜类合成中重要的限速酶［5］，可催化两个异构的IPP分子合成为牦牛儿基焦磷酸［6－8］，GPP合成酶在多种植物中都有分离报道，但对该酶的研究多数停留在酶的一般研究水平上。其较少研究发现该酶是由一个功能异构的二聚体组成，分别带有大小两个亚基［9－11］(下文用LT、ST表示)。本实验从薄荷中克隆GPP合成酶基因，构建植物表达载体。最终采用基因工程技术的方法，为提高薄荷醇生物合成水平，改善食品的营养价值和风味品质，改造遗传物质［12－13］，优化种植资源奠定基础。

2011－07－18 *通讯联系人

韩瑞(1987－)，女，在读硕士，主要从事植物分子生物学方面的研究。

国家自然基金(31060148)。