正交优化超声波提取酸茶总黄酮工艺的研究

武晓燕，唐源江，吴增丁

(华侨大学生物工程与技术系，福建厦门361021)

正交优化超声波提取酸茶总黄酮工艺的研究

武晓燕，唐源江*，吴增丁

(华侨大学生物工程与技术系，福建厦门361021)

目的:采用正交实验设计探讨酸茶中黄酮提取的最佳工艺条件。方法:运用超声技术提取酸茶黄酮，用比色法测定黄酮提取率。结果:影响超声提取酸茶中黄酮的因素:乙醇浓度＞提取温度＞料液比＞提取时间，最佳工艺条件为:以50%乙醇为提取溶剂，提取温度60℃、料液比1∶25、提取时间40min。最佳工艺条件提取黄酮提取率为7.1617%。结论:优化超声提取法提取酸茶中的黄酮，提取效率高，方法简便可行。

酸茶，杨梅叶蚊母树，总黄酮，超声波，正交实验

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

酸茶 泉州市售;芦丁对照品 国药集团化学试剂有限公司;其余试剂 均为国产分析纯。

V－1200可见分光光度计、UV－3200PCS紫外－可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司; KQ－250DE型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;循环水式多用真空泵 上海申光仪器仪表有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 黄酮样品的提取 精密称取酸茶粉末0.5g，根据文献［5－6］，初步选定提取温度、提取时间、料液比、乙醇浓度为:50℃、30min、1∶20、70%。进行120W超声提取，提取液冷却后抽滤，再用漏斗过滤，滤液用蒸馏水定容至50mL容量瓶，即为待测的酸茶样品液。

1.2.2 黄酮提取率的测定

1.2.2.1 芦丁标准溶液的配制 精确称取干燥至恒重的芦丁0.0400g，加适量70%乙醇溶解，转移至100mL容量瓶中，70%乙醇定容至刻度，配制成浓度为0.4mg/mL的芦丁标准液备用。

1.2.2.2 标准曲线的绘制 精确量取0.4mg/mL芦丁标准液0、0.5、1、1.5、2、2.5、3mL分别置于25mL容量瓶中，分别加70%乙醇至10mL，再加入5%NaNO2溶液0.5mL，摇匀放置6min;然后再加10%Al(NO3)3溶液0.5mL，摇匀放置6min;最后加入1.0mol/mL NaOH溶液10mL，定容至刻度，摇匀放置15min［7］。在紫外分光光度计中200～1000nm范围内扫描，测出最大吸收波长λmax位于510nm处。分别测量系列标准溶液浓度在最适波长510nm处的吸光度A。数据处理得回归方程:A=12.47143C+0.00447(R2= 0.9998，n=6)，芦丁溶液在0.008～0.050mg/mL范围与A值呈良好的线性关系。

1.2.2.3 样品含量测定 精确吸取样品液1mL，按标准曲线绘制项下方法测定其吸光度值，按下式计算黄酮提取率。

式中，C为待测液黄酮含量(g/L)，D为稀释倍数，V为提取液体积(mL)，W为样品干重(g)。

1.2.3 黄酮提取工艺

1.2.3.1 单因素实验 以乙醇作为溶剂，分析对黄酮提取效果影响最显著的几个因素:提取温度，提取时间，料液比，乙醇浓度。依次以其中一个因素为变量，其它各因素条件不变来考察黄酮提取率。

1.2.3.2 正交实验 根据单因素实验结果，选取提取温度、提取时间、料液比和乙醇浓度的三个水平为主要考察因素，以黄酮提取率作为考察指标，采用L9(34)正交表进行实验，每组实验重复3次取平均值，因素水平见表1。

表1 正交实验因素水平表Table 1 Factors and levels in orthogonal array design

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果

2.1.1 提取温度的影响 图1为以70%乙醇为提取溶剂，料液比为1∶20，提取时间为30min，超声功率120W下，提取温度对黄酮提取效果的影响。由图1可以看出，在30～50℃之间，随着温度增加，黄酮提取率不断增大，50℃时，黄酮提取率最高，提取温度超过50℃时，提取率逐渐下降。根据分子热扩散原理，温度升高，分子活动频率加大。在30～50℃之间，随着温度升高，黄酮类有效成分活动频率加大，渗出率提高，导致总黄酮提取率呈增加趋势;在50～70℃之间，黄酮类成分渗出率已经达到最大，且在较高温度下，黄酮成分可能发生变化、挥发等，而导致黄酮提取率略呈下降趋势。因此，在单因素考察下，最佳温度为50℃。

图1 提取温度对提取效果的影响Fig.1 Effect of ultrasonic temperature on extraction

2.1.2 提取时间的影响 图2为以70%乙醇为提取溶剂，料液比为1∶20，温度50℃，超声功率120W下，提取时间对黄酮提取效果的影响。结果表明，在10～30min之间，随着提取时间延长，黄酮提取率有明显的提高;30～40min之间，随着提取时间增加，黄酮提取率下降明显;40～50min之间，黄酮提取率又呈增加趋势;但60min后，含量再次下降。出现这一现象的原因可能:a.在时间40min、温度50℃、料液比1∶20、乙醇浓度70%组合条件下，部分黄酮类组分不稳定; b.酸茶植物组织结构对黄酮成分有效渗出造成的阻滞延迟;c.仪器造成的误差等。因此，在单因素考察下，结合能量损耗和工作效率，提取时间选择30min为宜。

图2 提取时间对提取效果的影响Fig.2 Effect of ultrasonic time on extraction

2.1.3 料液比的影响 图3为以70%乙醇为提取溶剂，提取时间为30min，温度为50℃，超声功率120W下，料液比对黄酮提取效果的影响。结果表明，随着料液比的增大，黄酮提取率也逐渐增大，当继续增加乙醇的量时，黄酮提取率呈下降趋势。料液比为1∶20时，黄酮提取效果最好。

表3 回收率测定结果Table 3 The determination result of recovery ratio

图3 料液比对提取效果的影响Fig.3 Effect of material－liquid ratio on extraction

2.1.4 乙醇浓度的影响 相比于水，黄酮类化合物在乙醇和甲醇中溶解性更好［8］，而甲醇有毒，一般不宜使用，因此黄酮提取溶剂选择一定浓度的乙醇。图4为在提取时间30min、提取温度50℃、超声功率120W下，乙醇浓度对黄酮提取效果的影响。由图4可知，乙醇浓度在30%～60%之间时，随着浓度增加，黄酮提取率明显增加;继续提高乙醇浓度，黄酮提取率反而下降明显;80%～90%之间，黄酮提取率几乎不变。天然黄酮类化合物多以糖苷形式存在，糖易溶于水，但甙元成分不易溶于水，当乙醇与水的比例达到最佳组合时，提取率最高。因此乙醇浓度为60%比较合适。

图4 乙醇浓度对提取效果的影响Fig.4 Effect of alcohol concentration on extraction

2.2 黄酮正交实验结果

精密称取酸茶0.5g，以L9(34)正交表安排实验，进行提取。以黄酮提取率为指标，考察不同因素对黄酮提取率的影响。结果见表2。

对实验结果进行直观分析，比较4个因素的极差R，结果表明影响黄酮提取率因素的大小顺序为乙醇浓度＞提取温度＞料液比＞提取时间，这说明乙醇浓度的大小对黄酮提取率的影响最大，其次是提取温度和料液比，最小是提取时间，因此，生产中应严格控制乙醇浓度。根据以上分析，结合其他因素综合考虑，最佳工艺条件为:乙醇浓度50%，温度60℃，料液比1∶25，提取时间40min。

表2 正交实验结果Table 2 The result of the orthogonal experiment

精密称取酸茶0.5g，按最佳提取工艺条件试提取，测定黄酮的含量(重复4次)，其含量分别为7.1526%，7.1507%，7.1689%，7.1745%，平均含量为7.1617%，RSD=1.18%。

2.3 显色稳定性和加标回收实验

精密量取样品溶液置于容量瓶中，其余操作均同1.2.2.2，每隔30min测定吸光度，测定至4h。结果显色稳定性良好，RSD=0.63%。

采用加标回收法［9］，精密称取已知含量的样品，分别加入含一定质量芦丁的对照品溶液，其余操作均同1.2.2.2，计算回收率，结果见表3。

3 结论

3.1 通过正交实验的极差分析得出:乙醇浓度和提取温度是影响酸茶黄酮提取率的最主要因素。

3.2 提取酸茶黄酮的最佳工艺条件为:乙醇浓度50%、提取温度60℃、料液比1∶25、提取时间40min，最佳条件提取酸茶中黄酮的平均含量为7.1617%。黄酮提取率较高，提取结果稳定，符合现代提取工业中省时、高效、节能的要求。

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Research of extraction technology of total flavonoids from acid tea using orthogonal experimental design

WU Xiao－yan，TANG Yuan－jiang*，WU Zeng－ding
(Department of Biotechnology and Engineering，Huaqiao University，Xiamen 361021，China)

Objective:The best extraction conditions of total flavonoids from acid tea were studied using orthogonal experimental design.Methods:Total flavonoids of acid tea were extracted and determined by using ultrasonic technique and colorimetry，respectively.Results:The factors influencing on extraction efficiency of total flavonoids were as follows:alcohol concentration＞temperature＞ratio of material to solution＞extraction time.The optimum technology was as follows:50%alcohol as extracting solvent，extraction temperature 60℃，the ratio of material to solvent 1∶25，the time 40min.The yield of total flavonoids from aicd tea was 7.1617%.Conclusion:The optimum technology of ultrasonic extraction for total flavonoids from acid tea was a more efficient and simple method.

acid tea;Distylium myricoides Hemsl;flavonoids;ultrasonic;orthogonal test

TS272.5+9

B

1002－0306(2012)08－0281－04

酸茶，是采集原植物杨梅叶蚊母树(Distylium myricoides Hemsl.)嫩叶而经与铁观音茶相同的工艺而制成的茶成品。杨梅叶蚊母树隶属金缕梅科(Hamamelidaceae)蚊母树属(Distylium)，国内分布于四川、安徽、浙江、福建、江西、广东、广西、湖南及贵州东部等地区［1］。常用作绿化树木，但由于它具消肿利尿功效，也可入药用于医治水肿、小便不利等症。在福建、浙江部分地区有采集其叶加工成茶的习惯，称其为野茶(主要浙江)，或酸茶、九条茶(福建)。杨梅叶蚊母树主要含有黄酮、二苯骈呋喃和鞣质类，具有抑制α－淀粉酶、α－葡萄糖苷酶和抗氧化性等活性［2］。据初步研究，酸茶不仅具有良好的清热解毒功能，还有较好地降低血脂、胆固醇等功效，因而引起人们的注意。目前，在福建的泉州、莆田等茶产业比较发达的地区已有成品茶上市，而对酸茶成品的化学成分研究目前尚属空白。超声波频率高于20kHz，并且不引起听觉的弹性波。很多研究表明，利用超声波产生的强烈振动、高的加速度、强烈的空化效应、搅拌作用等，可加速植物材料中的有效成分进入溶剂，从而增加有效成分的提取率，缩短提取时间，并且还可避免高温对提取成分的影响［3－4］。超声技术在有效成分提取方法研究中的广泛运用，已越来越为广大科学研究者所重视，并显示出其明显的优势。本文采用超声波提取酸茶中黄酮，采用比色法［5］对黄酮进行含量测定。以黄酮提取率为考察指标，通过正交实验，对酸茶中黄酮的提取工艺进行优选。

2011－07－18 *通讯联系人

武晓燕(1986－)，女，硕士研究生，主要从事植物种质资源研究与应用。

华侨大学高层次引进人才资助项目(09BS506)。