玉竹糖蛋白的分离纯化及理化性质的研究

邹柯婷，李 淼，陈 双，段玉峰，*，杜晓旭，杨 闻

(1.陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西西安710062; 2.深圳波顿香料有限公司，广东深圳518000)

玉竹糖蛋白的分离纯化及理化性质的研究

邹柯婷1，李 淼2，陈 双1，段玉峰1，*，杜晓旭1，杨 闻1

(1.陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西西安710062; 2.深圳波顿香料有限公司，广东深圳518000)

采用DEAE－52离子交换和Sephadex G－100柱层析法分离纯化玉竹糖蛋白粗品，得到了两种糖蛋白组分PDGP'－1和PDGP'－2，并对两种组分的理化性质进行了研究。结果表明，两种组分均为酸性糖蛋白，糖含量分别为75.22%和75.13%，蛋白质含量分别为16.35%和18.42%。红外光谱分析表明PDGP'－1中含鼠李糖、半乳糖和葡萄糖，PDGP'－2中含半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖和果糖。两种糖蛋白分子都含有吡喃糖环。

玉竹，糖蛋白，纯化，理化性质

玉竹(polygonatumodoratum(Mill.)Druee)属百合科黄精属植物玉竹类，是我国传统的药食同源类植物［1］，富含多糖、黄酮、生物碱和钾、钙、钠、铁、锰等矿物质元素［2－3］，可用于保健和食疗，具有降血脂、降血压、缓解动脉粥样硬化之功效［4－6］。目前，对玉竹的研究主要集中在其营养成分方面，对玉竹中糖蛋白等功能成分的研究尚未见报道，因此开发和利用玉竹有着极大的潜力和广阔前景［3］。本研究以成都中医大学附属医院出售的中药节状四川玉竹为原料，研究了玉竹糖蛋白的分离纯化及理化性质，为进一步开发利用玉竹提供了理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

玉竹 成都中医大学附属医院，产地四川; DEAE－52纤维素 Whatman公司;Sephadex G－100 Pharmacia公司;N，N'－亚甲基双丙烯酰胺Genview公司;其它试剂 均为国产分析纯。

Beckman121MB型氨基酸自动分析仪 美国Beckman公司;LXJ－ⅡB型低速大容量多管离心机 上海安亭科学医学仪器厂;Trace 2000型气相色谱仪 德国菲尼克斯公司;GM型真空冷冻干燥器 德国Christ公司;TU－1800紫外－可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;WZZ－ⅡB型自动旋光仪 上海精密科学仪器有限公司;DBS－100型全自动电脑收集器、DHL－A型电脑恒流泵 上海西仪分析仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 玉竹糖蛋白的提取及纯化

1.2.1.1 提取工艺流程 玉竹糖蛋白的提取采用微波辅助提取工艺［7］，提取出的玉竹糖蛋白经Savage法脱游离蛋白(氯仿∶正丁醇=4∶1，糖蛋白液∶Savage试剂=1∶5)、透析(自来水3d，蒸馏水1d)、沉淀、真空冷冻干燥后得玉竹糖蛋白粗品。

1.2.1.2 分离纯化 将处理好且悬浮于蒸馏水中的DEAE－52缓缓倒入柱中。柱外振动，以保证整个柱床内无气泡。蒸馏水预洗脱至流出液pH为7。

取0.3g玉竹糖蛋白粗品用5mL左右的蒸馏水在超声条件下溶解，然后将该溶液沿着柱壁缓慢加入DEAE－52层析柱。待大部分样品溶液被纤维素柱吸附后，用洗脱剂进行洗脱，洗脱剂依次为蒸馏水、0.1、0.2、0.3mol/L的NaCl溶液;流速:1.5mL/min;自动收集器以每10mL为一管依次进行收集。逐管检测收集液在280nm和490nm处的吸光度，以管数为横坐标，蛋白质和多糖含量为纵坐标，做洗脱曲线。合并收集同一峰位的洗脱液，浓缩、透析、干燥后得玉竹糖蛋白PFGP［8］。

将PDGP上Sephadex G－100凝胶柱(2.0m× 100cm)，用0.1mol/L NaCl溶液洗脱，方法同前，得玉竹糖蛋白组分PDGP'［9］。

1.2.2 玉竹糖蛋白的组成分析

1.2.2.1 氨基酸组成分析 取PDGP'20mg用18mL 6mol/L HCl溶液在110℃下真空充氮封管水解24h，取出冷却后移至50mL容量瓶中定容、摇匀。过滤后取滤液1mL于25mL烧杯中，40℃下蒸干，再加入3mL 0.02mol/L HCl，静置30min后搅拌均匀，用氨基酸自动分析仪进行分析［10］。

1.2.2.2 单糖组成分析 取15mg PDGP'置于安瓿中，加入8mL 2mol/L CF3COOH使其充分溶解后封管，于120℃条件下水解10h;分别向10mg标准单糖混合物、PDGP'水解物(P2O5干燥器中干燥24h)中加入0.2mL吡啶、0.2mL六甲基二硅胺烷和0.lmL三甲基氯硅烷(比例2∶1)，静置10min后高速离心，取上清液。分别对玉竹糖蛋白水解液和混合标准单糖样品进行气相色谱分析［11］。

1.2.2.3 PDGP'红外光谱分析 取1mg PDGP'和100mg溴化钾置于玛瑙研钵内，混合均匀后研细，取少量粉末制成标准压片，在500～4000nm条件下进行扫描分析［12］。

1.2.3 玉竹糖蛋白理化性质的测定

1.2.3.1 糖含量的测定 苯酚－硫酸法测定［13］，以葡萄糖为标准品。

1.2.3.2 蛋白质含量的测定 Folin－酚法测定［8］，以牛血清蛋白为标准品。

1.2.3.3 定性实验［14］280nm 处进行紫外扫描、碘－碘化钾反应、双缩脲反应、CTAB反应等。

1.2.3.4 (20±0.1)℃条件下，测定旋光度 参见文献［15］。

2 结果与讨论

2.1 玉竹糖蛋白的纯化

2.1.1 DEAE－52纤维素柱层析 合并洗脱曲线如图1所示。

由图1可知，经过DEAE－52柱洗脱后，玉竹糖蛋白得到了较好的分离，共计得到两种糖蛋白组分: PDGP－1(10～30管，蒸馏水洗脱)，PDGP－2(50～70管，0.1mol/L NaCl洗脱)。收集这两个峰所对应管中的洗脱液，透析、冻干。

2.1.2 SephadexG－100凝胶柱层析 分别将PDGP－1和PDGP－2两种组分上Sephadex G－100凝胶柱，用0.1mol/L NaCl溶液进行洗脱，以每10mL为一管依次进行收集，流速控制为1.5mL/min。分离效果见图2。

图1 DEAE－52分离PDGP的柱层析图谱Fig.1 Elusion chromatogram of PDGP on DEAE－52

图2 PDGP－1和PDGP－2的SephadexG－100柱层析图谱Fig.2 Elusion chromatogram of PDGP－1＆PDGP－2 on Sephadex G－100

PDGP－1和PDGP－2在Sephadex G－100柱层析过程中呈现单一且较对称吸收峰，且流出曲线中糖峰和蛋白峰出峰时间一致，说明它们在DEAE－52柱层析中得到了有效分离。收集各吸收峰主峰部位对应管中的洗脱液，真空冷冻干燥后得玉竹糖蛋白PDGP'－1、PDGP'－2，进行组成分析和理化性质研究。

2.2 玉竹糖蛋白的组成分析

2.2.1 氨基酸组成分析 氨基酸自动分析仪测定玉竹糖蛋白PDGP'－1、PDGP'－2的氨基酸组成，结果如表1所示。

表1 玉竹糖蛋白均一组分氨基酸组成及含量(g/100g)Table 1 The amino acid composition and content of each glycoprotein(g/100g)

由表1可知，PDGP'－1、PDGP'－2都含有18种能够测出的氨基酸，其中天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸含量较高。

2.2.2 单糖组成分析 混合单糖气相色谱分析如图3所示。

图3 混合标准单糖气相色谱图Fig.3 GC of mixed standard monosacharides

气相色谱中单糖与主要色谱峰的对应关系如下:4.187为阿拉伯糖，4.305为鼠李糖，4.55、4.718为核糖，5.182为木糖，6.282为甘露糖，6.403为果糖，6.812为半乳糖，6.855为山梨糖，7.115为葡萄糖。

玉竹糖蛋白PDGP'－1、PDGP'－2的气相分析结果如图4、图5所示。

图4 PDGP'－1水解物气相色谱图Fig.4 GC of Hydrolysates of PDGP'－1

图5 PDGP'－2水解物气相色谱图Fig.5 GC of Hydrolysates of PDGP'－2

分别将玉竹糖蛋白PDGP'－1、PDGP'－2的水解物气相色谱图与混合标准单糖气相色谱图对比，可看出PDGP'－1中的多糖主要由鼠李糖、半乳糖、葡萄糖组成，PDGP'－2主要由半乳糖、葡萄糖组成，含少量的阿拉伯糖和果糖。

2.2.3 红外分析 玉竹糖蛋白PDGP'－1、PDGP'－2的红外光谱分析结果见图6、图7。

图6、图7可知，两种样品在3400、2900、1640、1400cm－1附近都有吸收峰，这是多糖和蛋白分子的特征吸收峰。1400cm－1附近的吸收峰是C－H变角振动吸收;3400cm－1附近的吸收峰说明分子内可能存在O－H;2900cm－1附近较弱的吸收峰是由C－H伸缩振动所引起;1000～1075cm－1的吸收峰提示PDGP'－1、PDGP'－2的分子都含有吡喃型糖环［16］。

图6 PDGP'－1的红外光谱图Fig.6 The infrared spectrum of PDGP'－1

图7 PDGP'－2的红外光谱图Fig.7 The infrared spectrum of PDGP－2'

2.3 理化性质

定性实验结果见表2。

表2 PDGP'－1和PDGP'－2的理化性质Table 2 Physicochemical characteristics of PDGP'－1 and PDGP'－2

由表2可知，PDGP'－1的糖含量为75.22%，蛋白质含量16.35%;PDGP'－2的糖含量为75.13%，蛋白质含量18.42%;两种组分均易溶于水，难溶于甲醇、丙酮等有机溶剂。与碘－碘化钾反应不显蓝色，说明两种组分均是非淀粉类多糖;双缩脲反应呈阳性，说明PDGP'－1、PDGP'－2糖链结构中含有蛋白质;CTAB络合反应呈阳性，说明其为酸性物质，初步判定玉竹糖蛋白为酸性糖蛋白。紫外扫描280nm处出现显著吸收;两种组分均为右旋物质。

3 结论

对玉竹糖蛋白粗品用 DEAE－52纤维素及Sephadex G－100柱层析纯化，得两种糖蛋白组分PDGP'－1、PDGP'－2。两种玉竹糖蛋白均含有能够测定的氨基酸，并具有相同的氨基酸种类。经气相色谱及红外光谱分析测定，PDGP'－1、PDGP'－2都含有吡喃型糖环，PDGP'－1中的糖链主要由葡萄糖、半乳糖和鼠李糖组成，PDGP'－2中的糖链主要由葡萄糖、半乳糖组成，含少量的果糖和阿拉伯糖。

［1］全国中草药汇编编写组.全国中草药汇编［M］.北京:人民卫生出版社，1978:84.

［2］Rees D A.Estimating of the relative amounts of isomeric sulphate esters in some sulphated Polysaccharides［J］.Chem Soc，1961，32:5168－5171.

［3］彭秧锡，刘士军，郭军，等.玉竹的研究开发现状与展望［J］.食品研究与开发，2005，26(6):120－122.

［4］江苏新医学院.中药大辞典［M］上海:上海人民出版社，1977:1156.

［5］林厚文，韩公羽，廖时首.中药有效成分研究［J］.药学学报，1994，29(3):215.

［6］lhami Gülçin，Münir Oktayb，Ekrem Kireçc Ö，et al. Screening antioxidantand antimicrobialactivities ofanise (Pimpinella Anilum L.)seed extracts［J］.Food Chemistry，2003，83(3):371－382.

［7］陈双.玉竹糖蛋白的分离纯化及抗氧化作用研究［D］.西安:陕西师范大学，2009.

［8］张龙翔.生化实验方法与技术［M］.第二版.北京:高等教育出版社，1997:138－140.

［9］詹玲，潘思轶.大豆糖蛋白的分离纯化及结构分析［J］.食品科学，2006，27(12):594－596.

［10］Ei－dondity S E，Khalifatl，Ammar Ha，et al.Chemical and biological study of Sophora japonica Growin in Egypt［J］.Al－Azhar J Pharm Sci，1999，24:230.

［11］王应强.丹参糖蛋白的分离纯化与生物活性研究［D］.西安:陕西师范大学，2007.

［12］Santanam N，Ramachandran S，Parthasarathy S.Oxygen radicals，antioxidants，and lipid peroxidation［J］.Semin Reprod Endocrinol，1998，16:275－80.

［13］张惟杰.糖复合物生化研究技术［M］.第二版.杭州:浙江大学出版社，1999:124.

［14］阚建全.甘薯糖蛋白的糖链结构与保健功能研究［D］.重庆:西南农业大学，2003.

［15］童朝阳，林福生，张守兰，等.褶纹冠蚌Cristaria plicata提取物抗肿瘤作用的实验研究［J］.中国海洋药物，2003(3): 20－23.

［16］张卫明.玉竹儿童洁肤护肤品的配方设计［J］.中国野生植物资源，2001，20(3):28－29.

Study on isolation，purification and physicochemical properties of glycoprtein from Polygonatum odoratum

ZOU Ke－ting1，LI Miao2，CHEN Shuang1，DUAN Yu－feng1，*，DU Xiao－xu1，YANG Wen1
(1.College of Food Engineering and Nutritional Science，Shaanxi Normal University，Xi’an 710062，China; 2.Shenzhen Boton Flavours＆Fragrances Co.，Ltd.，Shenzhen 518000，China)

Two glycoproteins named PDGP'－1，PDGP'－2 were isolated and purified from the Polygonatum odoratum by the DEAE－52 and Sephadex G－100 column chromatography.Their physical and chemical properties were also studied.The results showed that both two glycoproteins were acidic glycoproteins.The sugar content of PDGP'－1，PDGP'－2 were:75.22%，75.13%，protein content were:16.35%，18.42%.IR analysis showed that PDGP'－1 contained rhamnose，galactose and glucose，PDGP'－2 contained galactose，glucose，arabinose and fructose.Both two glycoproteins contain pyran ring.

Polygonatum ordoratum;glycoprotein;purification;physicochemical properties

TS201.2+1

A

1002－0306(2012)08－0191－04

2011－07－19 *通讯联系人

邹柯婷(1986－)，女，硕士研究生，研究方向:食品功能成分的开发利用。

陕西省自然科学基础研究计划项目(2006B18)。