显微图像处理技术快速检测酵母菌总数

孙钟雷，万 鹏

(1.长江师范学院生命科学与技术学院，重庆408100; 2.华中农业大学工学院，湖北武汉430070)

显微图像处理技术快速检测酵母菌总数

孙钟雷1，万 鹏2，*

(1.长江师范学院生命科学与技术学院，重庆408100; 2.华中农业大学工学院，湖北武汉430070)

采用显微图像处理技术快速检测酵母菌的数目。将生物显微镜、CCD摄像头、图像采集卡、计算机等组成硬件部分，利用Visual C++6.0软件编制酵母菌自动计数软件部分，最终形成酵母菌总数检测系统。利用该系统对啤酒酵母装片进行图像采集、图像预处理、阈值分割、图像增强、形态学处理，最后采用连通判别法和形状因子相结合进行酵母菌识别和数目统计。经显微镜直接计数法验证，结果表明此方法的平均相对误差为2.56%，对单个装片的检测时间不超过8s。显微图像处理技术简便快速、检测准确，可以用于酵母菌总数的检测，克服了传统微生物计数的不足。

酵母菌，微生物计数，显微图像处理，快速检测

1 材料与方法

1.1 材料与设备

啤酒酵母菌 北京北纳创联生物技术研究院;马铃薯葡萄糖培养基 青岛海博生物技术有限公司;铬酸 分析纯，重庆川东化工有限公司化学试剂厂。

303－3恒温培养箱 江苏省车台电器厂;SW－CJ－2FD超净工作台 苏州净化设备有限公司;ZDX－35BI蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂;细口滴管、血球计数板、接种环、玻片等 成都科龙化玻厂; B104LED生物显微镜 重庆奥特光学仪器有限公司;DXC－390P 3 CCD型彩色摄像头 日本SONY公司;Matrox MeteorⅡ图像采集卡 加拿大Matrox公司;计算机 IBM公司。

1.2 酵母菌总数检测系统

酵母菌总数检测系统主要包括硬件和软件两部分。硬件部分:B104LED生物显微镜，DXC－390P 3 CCD型彩色摄像头，Matrox MeteorⅡ图像采集卡，计算机。软件部分:应用Microsoft Visual C++6.0自行开发的酵母菌自动计数系统和控制系统。

1.3 酵母菌的前处理

将啤酒酵母菌在无菌条件下接种到马铃薯葡萄糖培养基上，置于28℃恒温培养箱中恒温培养，然后制成酵母菌悬液。采用铬酸洗液对载玻片和盖玻片进行处理，在无菌条件下取酵母菌悬液的稀释液，在载玻片上涂成均匀的薄薄的一层，盖上盖玻片，制成装片待用。

1.4 酵母菌总数检测方法

先将酵母菌总数检测系统安装调试完毕，把处理好的装片置于生物显微镜上，调好焦距，打开酵母菌自动计数系统界面。点击“图片处理”菜单，使用“图像采集”子菜单采集到酵母菌图片，然后使用“去除噪声”、“灰度处理”等命令进行图片预处理，再使用“图像分割”、“图像增强”、“形态学处理”等命令对图片进一步处理，最后点击“酵母菌计数”菜单，自动统计图片中酵母菌数目。

1.5 酵母菌总数的验证方法

采用显微镜直接计数法［1］对酵母菌总数进行验证。用无菌的细口滴管取酵母菌悬液的稀释液，滴入血球计数板，并置于显微镜载物台，进行镜检、人工统计数目。

2 结果与分析

2.1 显微图像处理

2.1.1 图像预处理 由于生物显微镜电源本身的干扰噪声、光照度不均匀等问题都会影响到图片采集的效果，以至于影响酵母菌的计数，采用中值滤波和线性灰度变换法对酵母菌图片进行预处理，结果如图1。

图1 酵母菌图像预处理比较Fig.1 Contrast of the yeast’s preprocessing image

图1(a)为未经处理的图像，带有很大的噪声，图像很不清晰;图1(b)为处理后的图像，图片背景中的暗纹几乎被清除，大部分噪声被去掉，得到了较清晰的图片，采用灰度处理后将原图转化为灰度图以便下一步的图像分割。

2.1.2 图像分割 采用直方图阈值法进行图像分割。利用Visual C++6.0软件，在Dialog中完成直方图对话框的设计，在“图片处理”的子菜单中添加“图像分割”菜单，然后在其按钮中添加“ONTXFG”类创建程序，直方图如图2所示。由图2可以看出，直方图中有明显的波峰和波谷，说明物体和背景之间的灰度级有明显的差别，此法可行。根据直方图对话框选择波峰和波谷确定其阈值，其中红色阈值区间为77～100，绿色阈值区间为76～97，蓝色阈值区间为74～100。利用直方图阈值进行图像分割，得到二值图像，如图3所示。

图2 酵母菌直方图对话框Fig.2 Dialog box of the yeast’s image histogram

图3 酵母菌图像分割处理比较Fig.3 Contrast of the yeast’s image segmentation

2.1.3 图像增强 由于图像分割后得到的酵母菌二值图像有很多噪声干扰和杂质点，采用自适应平滑法对图像进一步增强处理。在“图片处理”的子菜单中添加“图像增强”菜单，然后在其按钮中添加“ONTXZQ”类创建程序，处理结果如图4所示。

图4 酵母菌图片的图像增强处理比较Fig.4 Contrast of the yeast’s image enhancement

从图4中可以看出，酵母菌图片经过增强处理后，图片背景中的杂质点大部分被去除，得到的酵母菌图片效果清晰，并且保留了一定的边缘信息，此法有助于提高酵母菌计数的精确性。

2.1.4 形态学处理 由于增强处理后的酵母菌图像边缘有毛刺、内部有空洞，选用形态学中腐蚀和膨胀运算进行处理。图像腐蚀的作用是清除物体边界点，使边界向内部收缩的过程，可以把小于结构元素的物体去除，而图像膨胀的作用与腐蚀的作用正好相反，它是对二值化物体边界点进行扩充，将与物体接触的所有背景点合并到该物体中，使边界向外部扩张的过程。在“图片处理”的子菜单中添加“图像形态学处理”按钮，然后在其按钮中添加“ONTXXINGTXCL”类，创建程序，处理结果如图5所示。

图5 酵母菌图像形态学处理比较Fig.5 Contrast of the yeast’s morphologically processing image

从图5中可以看出，膨胀对填补图像分割后物体中的空洞很有用。经过腐蚀和膨胀处理后的酵母菌图片边缘没有毛刺、内部没有空洞、得到了没有杂质存在的二值图像，可以对其进行计数。

2.2 酵母菌总数测定

2.2.1 连通区域的标记 采用连通判别法［12－14］对图像处理后的酵母菌二值图像进行连通区域标记。具体算法为:将图像按照从左向右，从上向下的顺序扫描，如果遇到第一个前景点，假设为A点，把A点做种子点，将其标记值设为1，并向外寻找与其邻域相连的其它前景点，将找到的每个这样点的标记值都设为1，再分别以每个这样的点为种子点继续寻找，直至找不到未标记过的相连的前景点为止，这样一个连通区域就标记完毕。如此反复，直到扫描完整幅图像，最后把所有连通区域标记完毕。

2.2.2 酵母菌的识别 如果所采集的酵母菌图片中不含其它干扰物质，那么图像中的酵母菌数即为最大连通区域标号数。但是由于培养基或者制作装片过程受到污染，酵母菌图像中就会有一些干扰杂质。通过对酵母菌微观形态图片观察和微观尺寸测量可知，酵母菌在不同生长期的形状都是卵圆形，多数是单体，少数带有芽体;长约6～14μm，宽约4.5～8μm，长宽比小于2;干扰物质的尺寸小，与酵母菌尺寸差异大。因此，引入形状因子［13］对酵母菌进行识别。利用数学运算找到所标记连通区域的长、宽、面积和周长，定义因子a，a=4πS/L2，其中S、L分别为连通区域的面积和周长，a的上限为1，因为酵母菌细胞多是卵圆形，所以a的上限取1.3;再定义b=c/d，其中c、d分别为连通区域的长和宽，对单体酵母菌，b小于2，对于有芽体的酵母菌，根据出芽酵母菌记数原则，芽体大小达到母细胞的一半时，作两个菌体计数，此时b大于3。针对酵母菌形态，结合两种形状因子，制定如下识别规则:对酵母菌二值图片中的连通区域，满足d＞4.5μm，a＜1.3，且1≤b＜2的识别为1个酵母菌;满足d＞4.5μm，2≤b≤3的识别为1个酵母菌;满足d＞4.5μm，b＞3的识别为2个酵母菌。

2.2.3 酵母菌的数目统计 将连通区域标记算法和酵母菌识别规则程序写入到“酵母菌计数”菜单中。对显微图像处理过的酵母菌图片，点击“酵母菌计数”菜单进行酵母菌的数目统计为11。

应用本方法对10份酵母菌装片进行总数测定，并用显微镜直接计数法进行验证，验证结果用相对误差表示，相对误差=|人工计数－自动计数|÷自动计数×100%，结果见表1。

表1 酵母菌总数的检测结果Table 1 Validation of the yeast’s total number

从表1可以看出，自动计数结果与人工计数结果(3次人工计数的平均值)相比较，最大相对误差为6.67%，最小相对误差为0，平均相对误差为2.56%。使用本方法对每份酵母菌装片检测时间不超过8s。

3 结论

3.1 本文研究的显微图像处理方法，简便快捷、检测准确，可以用于酵母菌总数的检测，在以后的研究中应进一步提高检测方法的精度和速度。

3.2 针对酵母菌形态设计的连通区域标记和形状因子相结合的酵母菌识别记数方法，能够区分干扰物质和酵母菌，能很好地进行酵母菌的计数。

3.3 通过对酵母菌图片进行处理，包括图像预处理、图像分割、图像增强和图像形态学处理，可得到非常清晰的酵母菌二值图片，利于酵母菌的计数。

3.4 通过显微镜直接计数法验证酵母菌自动计数方法，平均相对误差为2.56%，对单个装片的检测时间不超过8s。

［1］周德庆.微生物学实验教程［M］.北京:高等教育出版社，2006:109－113.

［2］中华人民共和国国家标准.食品卫生检验办法(微生物学部分)［S］.北京:中国标准出版社，1985.

［3］王国新，张长利，房俊龙，等.基于图像处理技术的菌落自动计数系统的研究［J］.中国乳品工业，2006，34(2):40－42.

［4］苑玮琦，张田文.血细胞图像的计数方法研究［J］.计算机应用与软件，2000，17(5):61－64.

［5］戴静，穆平安，戴曙光.图像法确定培养液中细胞个数的研究［J］.仪器仪表学报，2002，23(3):186－188.

［6］刘俊丽，薛河儒.基于图像处理的牛奶体细胞计数方法的研究［J］.内蒙古农业大学学报，2006，27(4):140－144.

［7］金声琅，李玉娟，殷涌光.采用显微图像识别技术快速检测食品细菌总数［J］.农业工程学报，2008，24(4):177－180.

［8］殷涌光，丁筠.基于计算机视觉的蔬菜中活菌总数快速检测［J］.农业工程学报，2009，25(7):249－253.

［9］ Takahiro Negishi， Satoru Nogami， Yoshikazu Ohya.Multidimensional quantification of subcellular morphology of Saccharomyces cerevisiae using CalMorph，the high－throughput image－processing program［J］.Journal of Biotechnology，2009，114:109－117.

［10］Kumar S，Mittal G S.Geometric and optical characteristics of five microorganisms for rapid detection using image processing［J］.Biosystems Engineering，2008，99:1－8.

［11］Osman Salih1，Han Remaut，GabrielWaksman，et al.Structural analysis of the Saf Pilus by electron microscopy and image processing［J］.Journal of Molecular Biology，2008，379: 174－187.

［12］喻杰，许化溪.一种易于实现的适于细胞图像连通区域的标记算法［J］.江苏大学学报:医学版，2005，15(2):152－154.

［13］周莹莉，曾立波，刘均堂，等.基于图像处理的菌落自动计数方法及其实现［J］.数据采集与处理，2003，18(4):460－464.

［14］曹长虎，李亚非.一种二值图像连通区域标记快速算法［J］.科学技术与工程，2010，10(33):8167－8170.

Applying digital micro－image processing on rapid detecting the total number of yeast

SUN Zhong－lei1，WAN Peng2，*(1.College of Life Science and Technology，Yangtze Normal University，Chongqing 408100，China;
2.College of Engineering，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China)

Digital micro－image processing technology on rapid detect the total number of yeast was studied.A detection system was made of the hardware and software，respectively.The biology microscope，CCD vidicon，image gathering card and computer were assembled the hardware，and the counting software was developed by Visual C++6.0 software.The image of Saccharomycse cerevisiae Hansen flake was gathered，processed，divided up，boosted up and morphologically processed by the detection system，then the yeast was identified and counted by the method of connected component labeling algorithm and shape factor.The result showed that the average error of detection system was 2.56%compared with directly counting using microscope，and detection time was less than eight seconds to one flake.The digital micro－image processing technology was simple，rapid and exact，which could detect the total number of yeast，and overcame the traditional microorganism counting.

yeast;microorganism counting;digital micro－image processing;rapid detection

TS207.4

A

1002－0306(2012)08－0105－04

酵母菌是一种常见的微生物，在食品发酵、酿造工业中广泛应用，但也是导致食品腐败的重要因素，因此对酵母菌总数进行测定具有重要的意义。对于微生物的计数，目前主要采用显微镜直接计数法［1］及平板菌落计数法［2］，这两种方法是经典的微生物数目验证方法，但是这些方法操作比较繁琐、耗时较长、效率低，因此，急需一种简便、快速的微生物计数方法。近年来，随着计算机技术的发展，图像处理方法已经和显微镜相结合，形成显微图像处理技术，应用于微生物数目的快速统计。目前研究主要集中在基于RGB色度学原理，自动检测菌落数量［3］;利用灰度图像处理和形态学运算，进行细胞数目统计［4－6］;使用计算机视觉检测系统，检测食品细菌总数［7－8］;利用显微镜和图像处理技术结合，分析微生物的三维形态结构［9－11］。应用显微图像处理技术对于酵母菌总数的检测尚未见报道。本工作拟使用显微图像处理系统，分析酵母菌图像，对酵母菌进行形态识别和数目统计，旨在研究一种简便、快速的酵母菌总数检测方法。

2011－07－27 *通讯联系人

孙钟雷(1979－)，男，博士研究生，讲师，主要从事食品智能检测与评价的研究。

重庆市教委科学技术研究项目(KJ101302);华中农业大学引进人才科研启动基金(52204－09079)。