酪蛋白磷酸肽的质量评价方法研究

陈雪香，罗 珍，刘 飞，黄曼曼，朱华伟，车 科，曹 庸，*

(1.华南农业大学食品学院，广东广州510640; 2.无限极(中国)有限公司，广东广州510665)

酪蛋白磷酸肽的质量评价方法研究

陈雪香1，罗 珍2，刘 飞1，黄曼曼1，朱华伟1，车 科1，曹 庸1，*

(1.华南农业大学食品学院，广东广州510640; 2.无限极(中国)有限公司，广东广州510665)

对来自8种不同公司的酪蛋白磷酸肽(CPP)产品的含量、体外结合钙离子的能力(即持钙能力)用不同的测定方法进行了测定和比较，采用氮磷比(N/P)、钡乙醇沉淀法测定样品含量，用pH滴定法和钙离子选择电极法测定了8种样品的体外持钙能力。研究结果表明:当酪蛋白磷酸肽含量较低时选用N/P和钡乙醇沉淀法测定结果偏差较大，应选用高效液相色谱法(HPLC);pH滴定法和钙离子选择电极法两种方法都能在一定程度上反映样品体外持钙能力的大小，但用pH滴定法测定的结果更符合产品含量的测定结果。本文为CPP开发过程中的质量评价提供了一定的依据。

酪蛋白磷酸肽(CPP)，质量评价体系，持钙能力，含量

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

CPP样品 来自8个不同公司样品。

G5砂心漏斗 广州广测仪器公司;DHG－9070鼓风干燥箱 上海齐欣科学仪器有限公司;超纯水发生器 美国millipore Milli－Q Synthesis;AL104万分之一电子天平 梅特勒仪器有限公司;LC－10高效液相色谱仪配紫外检测器 日本岛津公司; Diamonsil C18(250mm×4.6mm，5μm)色谱纯 迪玛公司。

1.2 实验方法

1.2.1 总氮和总磷含量测定

1.2.1.1 氮含量的测定 凯氏定氮法:采用GB5009.5－2010进行测定，消化样品后，用自动凯氏定氮仪蒸馏。为减小系统误差，每一个样品进行蒸馏之前，先用碱水对系统进行清洗，避免上一个样中会有氮的残留影响结果的准确性。

1.2.1.2 磷含量测定 采用 GB5413.22－2010进行测定。

1.2.2 乙醇钡沉淀法［7］检测CPP含量 称取2.0000g样品于烧杯中，加入20mL水，充分搅拌溶解。用2mol/L盐酸溶液调节pH至4.6，将溶液转移至离心管，于冷冻离心机5℃ 4000r/min离心30min。将上清液转移至原烧杯中，用2mol/L氢氧化钠溶液调节pH至6.8，转移入50.0mL比色管中，用少量水洗涤烧杯，一起并入比色管中，控制总量少于23mL。加入4.5mL 10%氯化钡溶液，再用水定容至25.0mL。加入无水乙醇，定容至50.0mL。于5℃冰箱放置12h以上。取出并将溶液倒入已干燥恒重的G5砂芯漏斗直接抽滤，用20mL 50%乙醇溶液分2～3遍洗涤比色管及沉淀物，继续抽滤至滤液澄清。将装有沉淀物的G5砂芯漏斗于105℃恒温烘箱内干燥至恒重。

1.2.3 高效液相色谱法［8］检测CPP含量 称取试样0.0400～0.0600g，置于10mL容量瓶中，加水溶解(可加热溶解)，定容至刻度线，然后过0.45μm滤膜，待用。

检测器:SPD－10A紫外检测器，CBM－10A控制器;色谱柱:检测波长:215nm;流动相A:水(0.1%TFA)，流动相B:乙腈;梯度洗脱条件(B%):10%～70%(30min)，70%～80%(10min)，10%(10min);柱温:常温。

1.2.4 pH滴定法［9］测定CPP体外持钙能力 准确称取样品0.1000g(以干物质计)于500mL烧杯中，加100mL 0.016mol/L的NaH2PO4将CPP溶解，将反应器置于25℃水浴中，加入浓度为0.016mol/L的CaCl2100mL，立即用0.1mol/L NaOH将反应体系调至pH 7.20，并不断滴加0.1mol/L NaOH，使反应液pH保持在7.20。从调节pH开始计时，在2min内将反应体系调至 pH 7.20，从2min开始连续记录 0.1mol/L NaOH的消耗量。以时间为横坐标，0.1mol/L NaOH的消耗量为纵坐标，得到持钙能力曲线。钙离子浓度是一定的，所以消耗的NaOH也是一定的，NaOH消耗时间的越长，说明其持钙能力越好，反之则相反。

1.2.5 离子选择性电极测定［10］测定CPP钙结合能力

准确称取适量CPP(大概含纯CPP 0.08g)样品于500mL烧杯中，然后加入100mL 5mmol/L氯化钙溶液、100mL 20mmol/L pH 8.0的磷酸二氢钾溶液及7.46g氯化钾，25℃下搅拌 30min，滴加 0.05mol/L NaOH将反应体系的pH保持在7.80，将活化过的钙离子选择电极和参比电极放入到烧杯中，记录好电动势的变化情况。

2 结果与分析

2.1 N/P法测定样品CPP含量

根据1.2.1.1和1.2.1.2中测定不同样品中N、P含量，并计算出N/P。从检测结果比较，其N/P的大小依次为:CPP5＞CPP2＞CPP7＞CPP4＞CPP3＞CPP6＞CPP1＞CPP8。

图1 不同样品的N/PFig.1 N/P of different sample

2.2 HPLC法测定样品CPP含量

用高效液相法检测样品中酪蛋白磷酸肽(CPP)含量，结果显示样品CPP6的酪蛋白磷酸肽(CPP)含量最高，为24.07%。从检测结果比较，其含量大小依次为:CPP6＞CPP3＞CPP2＞CPP4＞(CPP7，CPP5)＞CPP1＞CPP8。

图2 HPLC法不同样品中CPP含量比较Fig.2 Compare CPP content of various samples from HPLC analysis

2.3 乙醇－钡法测定样品CPP含量

乙醇－钡沉淀法测定各样品的酪蛋白磷酸肽(CPP)含量，结果如图3所示，由图3可知，样品CPP6的 CPP含量最大为 38.01%。样品 CPP4、CPP7、CPP8、CPP5和CPP3的酪蛋白磷酸肽(CPP)的含量均显示在20%～25%的范围内，其大小排序为CPP4＞CPP7＞CPP8＞CPP3。样品CPP2、CPP1的酪蛋白磷酸肽(CPP)最小，分别为19.95%、19.43%。

图3 乙醇－钡沉淀法不同样品中CPP含量比较Fig.3 Compare CPP content of various samples from ethanol－barium precipitation

2.4 pH滴定法测定酪蛋白磷酸肽(CPP)的体外持钙能力

酪蛋白磷酸肽(CPP)持钙能力曲线的测定结果如图4所示，从结果可以看出，CPP6样品的持钙能力明显优于其他样品，为38.7min，其余7个样品的持钙时间范围为17.7～29min具有良好的持钙活性，其活性强弱排序:CPP2＞CPP4＞CPP7＞CPP3＞CPP5＞CPP8＞CPP1。CPP2和CPP4号样品持钙时间要明显高于其余5个样品。

图4 不同CPP样品体外持钙能力比较Fig.4 Compare ability to hold calcium in vitro of various CPP’s samples

2.5 离子选择电极测定酪蛋白磷酸肽(CPP)钙结合能力

由钙离子选择电极测定样品持钙能力结果可以看出:CPP2、CPP3、CPP4样品的结合钙能力明显优于其它样品，其中CPP3样品最强，2g/L的CPP样品(绝对CPP浓度为0.4g/L)能溶解28.7mg/L，具有良好的结合钙的能力。CPP6、CPP7、CPP8的钙结合能力较弱，溶出的钙离子浓度仅为 3～5.9mg/L，而CPP1、CPP5不能从磷酸钙沉淀里溶解出游离钙。

图5 不同CPP样品体外钙结合能力Fig.5 Compare ability of Calcium－binding ability in vitro from various CPP’s samples

3 结论与讨论

3.1 从8种不同样品的N/P检测结果可知，样品的N/P的大小依次为 CPP5＞CPP2＞CPP7＞CPP4＞CPP3＞CPP6＞CPP1＞CPP8，冯凤琴等用四种不同来源的高纯样品研究得出CPP的N/P摩尔比可反映CPP的纯度和样品持钙能力的大小，N/P值越小，说明其CPP含量越高，磷酸根的密度越高，说明其持钙能力越强。不同条件下制得的CPP其组成结构、纯度、磷酸基的密度均存在差异，因而其持钙能力也不相同［11］。但本文实验结果与上述N/P和乙醇－钡沉淀法的的结果相差较大，而其持钙能力的大小与HPLC的分析结果较吻合。其原因可能是本文所选用的样品纯度较低，其中添加的其他成分对N/P结果影响较大，因此在测定酪蛋白磷酸肽样品的纯度时，如果样品CPP含量较低选用N/P测定样品的纯度有一定的局限性。乙醇－钡沉淀法其原理是沉淀可以和钡盐形成铬合物的组分，样品中添加的其他组分对结果也有一定的影响，故其结果与实际值偏差较大。HPLC方法针对样品中活性中心对样品纯度进行测定，目标性较强，准确，受影响因素较少。结合不同方法的测定原理，故8个不同样品的CPP含量大小依次为:CPP6＞CPP3＞CPP2＞CPP4＞CPP7＞CPP5＞CPP1＞CPP8。在测定样品CPP含量时，要考虑样品的CPP含量范围，高含量样品选用N/P法、乙醇－钡沉淀法或HPLC法其结果均是可信的，而当样品的CPP含量较低时选用目标性较高、准确性较好的HPLC法是最好选择。

3.2 本论文选用pH滴定法和钙离子选择电极法测定样品体外持钙能力结果存在差异。pH滴定法保持溶液pH在7.2，通过加入氢氧化钠的速度反映样品阻止磷酸钙沉淀的效果，根据测定NaOH消耗突然上升的时间来表征酪蛋白磷酸肽阻止磷酸钙沉淀的效果［9］。钙离子选择电极法，测定在一定条件下被CPP保持在溶液中的钙的数量。CPP对钙吸收的促进作用主要表现为CPP的核心部位在pH 7.8的条件下，能有效的与钙形成可溶性复合物，抑制不溶性沉淀的生成，避免钙的流失。最终可因游离钙浓度的提高而促进钙的被动吸收，钙离子选择电极通过测定用溶液中钙离子浓度判定样品结合钙量，以钙浓度大小判定样品结合钙能力的大小［10］。从本文的结果可知:pH法更加适用于商品化的CPP持钙活性检测，因为商品化的CPP通常已达钙饱和，钙饱和的CPP具有阻止磷酸钙沉淀的能力，即具有持钙活性;而钙离子选择电极法检测结果不能较好地体现出CPP的持钙活性，但脱钙的CPP具有从磷酸钙中结合钙的能力;所以要全面地评价CPP产品的活性，还需要两种方法结合起来。

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Study on the quality evaluation method on casein phosphopeptide(CPP)products

CHEN Xue－xiang1，LUO Zhen2，LIU Fei1，HUANG Man－man1，ZHU Hua－wei1，CHE Ke1，CAO Yong1，*
(1.College of Food Science，South China University of Agricultural，Guangzhou 510640，China; 2.Infinitus(China)Co.，Ltd.，Guangzhou 510665，China)

The quality determines the quality of casein phosphopeptide(CPP)products is very important for company.The article obtained a qulity evaluation system through compared different purity and calciumbinding capacities measures.The purity of 8 different samples examined and compared by N/P，Barium－ethanol precipitation and HPLC.The calcium binding capacities of casein phosphopeptide(CPP)were detected by pH titration technique and calcium ion－selective electrode.The result showed that purity examined by HPLC was more accurate when the sample’s purity was low and used the pH titration technique detected the calcium binding capacities was more chime in with the purity result.

casein phosphopeptide(CPP);quality evaluation system;the calcium binding capacities;content

TS201.2+1

A

1002－0306(2012)08－0075－04

酪蛋白磷酸肽(casein phosphor peptides，CPP)作为一种生物活性肽，是酪蛋白经适合的蛋白酶消化所得到的一系列含有磷酸丝氨酸簇:—Serp—Serp—Serp—Glu—Glu的短肽。这些磷酸丝氨酸残基在CPP的结构、功能、性质方面都起着至关重要的作用，比如结合钙、保持其在体系中足够大小的胶束等［1］。在碱性条件下，CPP可以防止钙、铁等离子的沉淀，从而促进它们的吸收。CPP也因此被称为钙促进因子［2－3］。研究表明，通过水解所获得的生物活性肽，其分子量较小，在小肠内可以以完整肽段的形式被人体吸收，安全性好，不会引起人体的免疫排斥反应，加之其具有生理功能强、用量少的独特优势，已越来越多地引起人们的重视，其工业化生产也成为当前功能性食品和生物医药行业发展的大趋势［4］。国内外相关研究文献多，但只针对酪蛋白磷酸肽的一个或几个指标对其进行评价，如黄祥元等［5］研究了CPP的N/P以期为生产高纯度的酪蛋白磷酸肽提供依据，N/P越低，CPP阻止磷酸钙沉淀效果越好。冯凤琴［6］等用钙离子选择电极的方法来测定不同CPP的体外持钙能力，但国内外文献并无建立CPP质量评价体系的相关研究的报道，本文对不同来源的样品采用N/P比方法、钡－乙醇沉淀法和高效液相色谱法(HPLC)判断样品中酪蛋白磷酸肽的含量;用pH滴定法和Ca离子电极法从两种不同角度测定样品的持钙能力，以期能够得出一套准确判断CPP产品的质量评价有效的方法，为工业化生产和检测提供依据。

2011－03－07 *通讯联系人

陈雪香(1981－)，女，硕士，助教，研究方向:功能食品及食品质量安全。