转基因植物REAL-TIME PCR方法检出限和定量限的研究

隋志伟，王 晶，*，李 亮，谢田法

(1.中国计量科学研究院，北京100013;2.北京工业大学，北京100124)

转基因植物REAL-TIME PCR方法检出限和定量限的研究

隋志伟1，王 晶1，*，李 亮1，谢田法2

(1.中国计量科学研究院，北京100013;2.北京工业大学，北京100124)

目前Real－time PCR(Rt－PCR)方法在转基因植物定量检测中应用最为广泛。有关该方法的检出限和定量限的计算并没有达成统一。本文采用统计模型对三种转基因植物进行实时荧光定量PCR方法检出限和定量限的研究。实验结果表明:转基因玉米NK603检出限5拷贝，定量限14拷贝;转基因棉花Mon15985检出限5拷贝，定量限12拷贝;转基因油菜Oxy235检出限4拷贝，定量限9拷贝。是利用统计学方法对转基因植物荧光定量PCR方法检出限和定量限研究的一个积极尝试，可用于其他转基因植物检测中检出限和定量限的确定。

转基因植物，检出限，定量限，统计容忍限

近年来，随着基因工程技术越来越多地应用于农作物改良，转基因作物逐渐在全世界范围内发展起来。转基因作物在全球范围的迅猛发展也使其食用安全和环境安全问题引起了各国政府和相关国际组织的高度重视。纷纷出台的转基因生物安全管理相应的法规对转基因生物从生产到上市的各个环节进行严格规范和监控［1］。转基因产品检测不但需要定性，还需要准确定量。目前采用Rt－PCR是转基因植物检测的金标准，确定此方法的检出限和定量限显得尤为重要。截止1995年，国际上出现了大量关于检出限和定量限这方面的概念。就检出限而言，不同术语的确切含义也有一定的差异。如有的是用统计的语言描述的;有的则是从检出实践出发，更多的是用文字描述的。即使同样用统计语言来表述，它们也有差别。如有的只考虑第一类错误，有的同时考虑两类错误(即假阳性和假阴性)。为了更好地指导实践，有些国际组织分别制定了有关的文件或标准［2－3］。但是，这些文件中的概念并不统一，给实际使用人员带来很大的不便，同时也不利于国际交流。为此，1995年经国际理论和应用化学联合会(IUPAC)和国际标准化组织(ISO)有关人员共同商议，由IUPAC和ISO分别颁布统一的术语用于国际化学和计量委员会 (internationalchemicaland metrological communities)等。尽管如此，有关检出限的计算问题并没有达成统一。ISO11843给出的检出限计算是基于区间估计的方法，而美国材料测试协会采用的是容忍区间的办法。美国环保署在对纯净水的有关检测中，考察了IUPAC等提出的方法，并在此基础上给出了单一实验室的检出限和定量限的评定办法［4］。本文将统计学方法应用在转基因植物检测中，以期利用异方差线性回收模型和相关实验对三种转基因植物进行实时荧光定量PCR方法检出限和定量限方面的研究。

表1 荧光定量PCR检测转化体引物和探针序列信息Table 1 Primer and probe sequences for real－time PCR detection of transformants

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

植物基因组提取试剂盒 天根生化科技(北京)有限公司;转基因植物纯阳基体样品 本实验室保存;转基因植物各转化体的内标外源引物探针(见表1) 由上海英骏公司合成;ddH2O Millipore。

振荡器 IKA;离心机 Sigma;AB7900荧光定量PCR仪，荧光分析仪(Fluoroskan Ascent)。

1.2 确定检出限和定量限的统计模型和方法

下面基于美国材料测试协会的有关标准［5－6］简要介绍其中确定检出限和定量限的核心思想。设在给定的真实浓度T下，实际测定结果Y满足:Y=a+ bT+ε·G(T)，其中ε:N(0，1)，称该模型为线性平均回收(mean recovery，MR)模型。现有的检测实践中，为了实际处理的方便，常常人为假定误差方差为常数，然而大多数情形下这样的假定不成立。此时，若仍采用常数方差模型就会对计算的结果造成很大的偏差。因此，有必要考虑测量数据的散布即方差依赖于浓度水平的情况，即异方差模型。

对标准差G(T)建模后，需要估计MR模型中的未知参数。注意，为了简便起见，G(T)的估计我们仅考虑常数、线性、指数和混合四种模型［5］。所以，如果是常数模型，则a，b的估计用普通最小二乘，否则，得用加权最小二乘。设其估计为^a，b^。

1.2.2 定量限的确定方法 误差标准差G(T)的拟合和建模同上。

Z%的LOQ记为LOQZ%，它的含义是在该浓度水平下，任一测定值具有Z%的相对标准差。Z一般取10、20、30，从小到大依次取，只要计算出的LOQZ%值没超出测定值的范围，则选用它作为定量限。否则，需要考虑使用部分数据或者是增加新的数据。计算方法如下，注意到LOQZ%满足T=100/ZG(T)，在不同的G(T)表达式下解出T即可。

1.2.3 实时荧光定量PCR方法分析

1.2.3.1 样品DNA的提取 称取100mg样品，按照植物基因组提取试剂盒说明书提取样品DNA。

表5 转基因油菜Oxy235内/外源基因PCR反应体系Table 5 The PCR reaction system of endogenous gene/exogenous gene in genetically modified canola Oxy235

1.2.3.2 样品DNA的质量检查 a.紫外分光光度法检测提取DNA纯度。将DNA适当稀释，测定并记录其在260nm和280nm的紫外光吸收率即A260和A280，用A260/A280来计算DNA的纯度(见表2)，当纯度范围在1.8～2.0之间说明样品DNA质量满足实验要求。对转基因植物纯阳基体样品提取DNA和进行紫外检测结果显示比值都处在1.8与2.0之间，结果表明提取的DNA质量很好地满足了定量PCR的要求。

b.荧光染料法测定DNA浓度。本方法采用荧光染料P7589能特异性的结合双链DNA，因此可以特异性测定双链DNA的浓度，受单链DNA、RNA和蛋白质的影响较小。具体操作步骤如下:

试剂的稀释:用ddH2O将原TE溶液(20×)稀释20倍，配制成1×TE溶液;用1×TE将原标准DNA(100μg/mL)稀释成2μg/mL;用1×TE将试剂盒中的染料P7589稀释200倍。

标准曲线的制作:打开荧光分析仪预热15min后，测定96孔点样孔板的本底荧光信号;用1×TE将标准DNA溶液(2μg/mL)进行10倍梯度稀释，然后与染料P7589溶液等体积混合，振荡混匀，将标准DNA溶液稀释成1000、100、10、1和0ng/mL;在点样板上每孔上样 200μL，以荧光分析仪 Fluoroskan Ascent测定样品的荧光信号(选择滤镜对 EX: 485nm;EM:538nm);将样品荧光信号扣除点样板本底荧光信号后，制作标准曲线(见图1)。

图1 标准曲线的建立Fig.1 Establishment of calibration curve

样品DNA纯度测定:荧光分析器仪器预热15min后，测定96孔点样孔板的本底荧光信号;以1 ×TE将待测样品进行10倍梯度稀释，稀释100倍后与染料P7589溶液等体积混合，振荡混匀;在点样板上每孔上样200μL，测定其荧光信号(选择滤镜对EX:485nm;EM:538nm)，利用标准曲线计算待测样品DNA浓度。

经过实验结果表明，我们所提取的DNA模板浓度见表2，可以满足实时荧光定量PCR检测需要。

表2 三种转化体提取的基因组DNA纯度和浓度Table 2 The purity and concentration of genomic DNA extracted from three transformants

1.2.3.3 各转基因植物Rt－PCR反应体系和反应条件 转基因植物Rt－PCR反应体系因转化体不同而异，三种转基因植物的Rt－PCR反应体系分别见表3～表5。各转化体的反应条件参数均相同，详见表6。

表3 转基因玉米NK603内/外源基因PCR反应体系Table 3 The PCR reaction system of endogenous gene/exogenous gene in genetically modified corn NK603

表4 转基因棉花Mon15985内/外源基因PCR反应体系Table 4 The PCR reaction system of endogenous gene/exogenous gene in genetically modified cotton Mon15985

表7 转基因玉米NK603的Rt－PCR结果Table 7 Rt－PCR result of genetically modified corn NK603

表8 转基因棉花Mon15985的Rt－PCR结果Table 8 Rt－PCR result of genetically modified cotton Mon15985

表9 转基因油菜Oxy235的Rt－PCR结果Table 9 Rt－PCR result of genetically modified canola Oxy235

表6 Rt－PCR反应程序Table 6 Rt－PCR reaction program

1.2.3.4 DNA模板的稀释 将各转化体DNA模板进行系列稀释(见表7～表9)，每个浓度水平作6个重复，直到检测不到信号为止。

2 结果与讨论

2.1 各转基因植物荧光定量PCR结果

将各转基因植物的纯阳基体作系列稀释进行Rt－PCR反应，分别作为模板进行荧光定量PCR反应，直至当模板到某一浓度检测不到信号为止，详细结果见表7～表9。

2.2 各转基因植物Rt－PCR反应检出限和定量限结果

根据实验设计所得出的各转基因植物Rt－PCR反应的测定数据，按照本文1.2的统计模型和方法计算得到各转基因植物Rt－PCR反应检出限和定量限结果，详见表10。

表10 各转化体Rt－PCR反应检出限和定量限结果Table 10 The results of LOD and LOQ in various transformants

2.3 讨论

随着近年来转基因植物的研究不断升温，有关转基因植物检测的重要性也日渐凸显，目前实时荧光定量PCR是公认用于转基因植物检测的首选检测方法，过去人们常常从样品检出数据来确定Rt－PCR方法检出限和定量限，由于不同仪器、不同实验操作者以及不同实验批次之间的差别，得出的检出限和定量限数据往往差别比较大，而应用统计学模型得出的检出限和定量限数据相对科学可靠。已有文献报道使用统计学方法推断荧光定量 PCR检测限的［7］，目前多应用于医学领域，并没有应用于转基因植物检测的相关文献。本文选用美国材料测试协会的有关标准给出的基于统计学的方法，ISO11843给出的方法主要是基于线性或非线性校准情形。传统的3σ和10σ的方法仅适用于常数标准差情形，这在实际中往往很少满足。而ASTM6091和6512给出的方法则考虑了包括常数标准差在内的四个备选模型，因而其适用范围最广。同时确定选择方法时应考虑的一些原则(如可操作性、实施费用等);其次，对基因检测数据的特点进行详细的分析(包括正确性、精密度和不确定度及统计分析等);然后，确定适用于基因检测方法的检出限和定量限的计算方法，并就选择的方法设计合理的水平(即选择测试多少个不同水平，这些水平怎么确定等)。最后，对所选的方法进行一定的验证，以说明合理性。通过以上的研究工作，在实验数据统计基础上，我们得出三种转基因植物Rt－PCR反应检出限和定量限结果分别为:转基因玉米NK603检出限5拷贝，定量限14拷贝;转基因棉花Mon15985检出限5拷贝，定量限12拷贝;转基因油菜Oxy235检出限4拷贝，定量限9拷贝。

本文研究建立的转基因植物实时荧光定量PCR反应检出限和定量限确定方法，是利用统计学方法对转基因植物荧光定量PCR反应检出限和定量限研究的一个积极尝试，可用于其他转基因植物检测中检出限和定量限的确定，并通过在今后其他转基因植物检测中的应用而使该方法得到不断的完善。

［1］邓汉超，尹长城，刘国振，等.转基因植物核酸成分检测技术研究进展［J］.中国生物工程杂志，2011，31(1):86－95.

［2］FreiserH，NancollasGH.Compendium ofanalytical nomenclature［M］.1sted.Oxford:Wiley－Blackwell，1978.

［3］Wilrich P，ISO 11843－2－2000，Capability of Detection［S］. USA:ISO/TC69/SC6，ISO，2000.

［4］EPA，Revised assessment of detection and quantitation approaches［R］.EPA，2004.http://www.epa.gov/waterscience/ methods/det/faca/techworkgroup/

［5］ASTM D6091－07.Standardpracticefor99%/95% interlaboratory detection estimate(IDE)for analytical methods with negligible calibration error［S］.USA:ASTM，2007.

［6］ASTM D6512－07.Standard practice for interlaboratory quantitation estimate［S］.USA:ASTM，2007.

［7］王文清，王昌富，袁琳，等.实时荧光定量PCR检测限的统计推断［J］.实用医技杂志，2007，14(11):1382－1383.

Study on limit of detection and limit of quantification of Real－time fluorescence quantitative PCR in gene modified plant

SUI Zhi－wei1，WANG Jing1，*，LI Liang1，XIE Tian－fa2
(1.National Institute of Metrology，Beijing 100013，China; 2.Beijing University of Technology，Beijing 100124，China)

At present，Real－time PCR(Rt－PCR)is the most widely used in the quantitative detection of gene modified plant.Calculation of the limit of detection(LOD)and limit of quantification(LOQ)in this method was not obtained consistency.The LOD and LOQ of real－time fluorescence quantitative PCR in three kinds of gene modified plants were studied by statistical model.The results showed that LOD and LOQ of transgenic maize NK603 were 5 copies and 14 copies，respectively.LOD and LOQ of transgenic cotton Mon15985 were 5 copies and 12 copies，respectively.LOD and LOQ of transgenic canola Oxy235 were 4 copies and 9 copies，respectively.An active try on LOD and LOQ of transgenic plant was studied by statistical method，which could be used to determine the LOD and LOQ of other gene modified plants.

gene modified plant;limit of detection(LOD);limit of quantification(LOQ);statistical tolerance limits

TS207

A

1002－0306(2012)08－0059－05

2011－07－15 *通讯联系人

隋志伟(1980－)，男，博士，助理研究员，主要从事微生物学和转基因植物等生物计量方面的研究。

国家转基因生物新品种培育科技重大专项(2008ZX08012003);国家科技支撑计划(2008BAK41B01)。