一株芽孢杆菌的分离鉴定及其在发酵酱渣研究中的应用

王红涛，罗立新，张士伟

（华南理工大学生物科学与工程学院，广东广州510006）

一株芽孢杆菌的分离鉴定及其在发酵酱渣研究中的应用

王红涛，罗立新*，张士伟

（华南理工大学生物科学与工程学院，广东广州510006）

从酱渣中筛选分离出一株芽孢菌株，通过生理生化实验以及16S rDNA鉴定其为地衣芽孢杆菌，将该菌种应用于发酵酱渣研究，表明用液态发酵方式较好，当酱渣与玉米淀粉比例为1∶1时，获得的活菌数较多。对添加辅料元素进行正交实验优化结果表明，当培养基中MgSO4为3g/L，MnSO4为2g/L，CaCO3为3g/L时，培养基中的活菌数最多，为6.55×109cfu/mL。

酱渣，地衣芽孢杆菌，正交实验优化，液态发酵

酱渣是酿造酱油后产生的废渣，我国酱油年产量约500万t，生产酱油会产生大量的废渣[1]。酱渣中含有丰富的粗蛋白、粗脂肪等营养物质，是一种良好的饲料资源。近年来，随着人们对环境保护及饲料安全意识的不断加强，“无公害饲料”、“生态饲料”、“环保饲料”、“有机饲料”和“绿色饲料”等倍受关注[2]。用益生菌发酵饲料是当前饲料研究的一个热点方向。地衣芽孢杆菌是一种重要的益生芽孢菌，早在2003年12月我国农业部发布的第318号公告“饲料添加剂品种目录”中就有地衣芽孢杆菌。本实验尝试用地衣芽孢杆菌发酵酱渣，为实现酱渣饲料工业化的应用提供了借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

酱油渣 由广州市广味源食品有限公司提供；细菌基因组DNA小量提取试剂盒 购自北京普博欣生物科技有限责任公司；MgSO4广州化学试剂厂；MnSO4天津市大茂化学试剂厂；CaCO3天津市永大化学试剂开发中心，分析纯；发酵的种子培养基 LB液体培养基。

SKY-2102C立式双层小容量全温度恒温培养摇床 上海苏坤；GSP-9160MBE隔水式恒温培养箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；SW-CJ-1F型单人双面净化工作台 苏州净化；UV-2012 PC型紫外可见分光光度计 上海达平仪器有限公司；Eppendorf PCR仪 德国Eppendorf公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种分离筛选以及鉴定

1.2.1.1 芽孢杆菌的分离筛选 取10g湿酱油渣研碎后，加入至100mL无菌生理盐水中，然后取其中5mL加入至95mL LB液体培养基中，在37℃下，以转速150r/min进行富集培养24h后。获得的菌悬液在90℃水浴中孵育10min，取1.0mL菌悬液，以无菌水稀释成104、105、106倍3个浓度梯度。取不同梯度菌悬液0.1mL涂布于LB平板，37℃培养24~48h。通过芽孢染色，挑选出具有芽孢的菌落，用LB平板划线培养，获得单菌落Tao1[3]。

1.2.1.2 芽孢杆菌表型及生理生化鉴定 将Tao1在LB固体培养基上划线，然后在37℃下培养24h，观察菌落形态并挑取单菌落，做革兰氏染色和生理生化实验[4]。

1.2.1.3 芽孢杆菌的16S rDNA鉴定 取Tao1单个菌落接种于10mL的LB液体培养基中，在37℃下150r/min摇床中培养24h后，取样提取基因组，然后用细菌的16S rDNA通用引物，即上游引物F：5’-agagttgatcctggctcag-3’，下游引物R：5’-ggttaccttgttacgactt-3’，进行PCR扩增，其条件为：94℃预变性5min，然后94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，共30个循环，最后72℃延伸10min。得到的PCR产物送上海英潍捷基生物技术有限公司测序。利用BLAST将测定的供试菌株Tao1的16S rDNA序列与GenBank中所有已测定的芽孢杆菌属16S rDNA基因序列进行同源序列分析比对，得到Tao1所在的菌属。然后与相关菌属的典型菌种一起用MEGA5b61软件进行系统发育树的构建。

1.2.2 酱渣的预处理 未脱盐酱渣的制备：将湿酱渣放置于80℃烘箱中进行烘干48h，然后用植物粉碎机进行粉碎，过60目筛，然后密封放置于室温下保藏[5]。

脱盐酱渣的制备：将湿酱渣与蒸馏水混合（w/v= 1/10），搅拌5min后，用四层纱布进行过滤，即为一次脱盐，重复该操作为二次脱盐，然后将脱盐后的酱渣放置于80℃烘箱中烘干48h，然后用植物粉碎机粉碎，过60目筛，然后密封放置于室温下保藏。

1.2.3 菌种的毒性实验 参照中华人民共和国安全毒理学评价程序（试行），按照《饲料大全》的急性毒性实验方法，对芽孢杆菌Tao1进行毒性实验。将Tao1干菌粉用无菌生理盐水稀释后，按15g/kg的剂量给小白鼠灌服。对照组只灌服无菌生理盐水，连续观察1周[6]。

1.2.4 菌种培养条件 菌种种子液制备：从划线平板上挑取单个菌落，接种至10mL LB液体培养基中，培养48h后，4℃冰箱保藏。菌种培养条件的优化：分别在28、30、35、37、40℃培养该菌种，24h后测定其OD值，确定该菌种的最适生长温度；分别在150、200、250r/min下培养，24h后测定其OD值，确定最佳转速；分别在pH6.0、6.5、7.0、7.5、8.0下培养，24h后测定其OD值，确定其最佳pH。菌种生长曲线的测定：从保藏的种子培养基中，取1mL加入到装有100mL LB溶液的500mL锥形瓶中，以200r/min转速，在30℃下，每隔一定时间取样，在600nm下测定OD值，并绘制生长曲线。

1.2.5 菌种发酵培养基以及培养方式的优化

1.2.5.1 培养方式的选择 固态发酵：取100g酱渣于

115℃下灭菌20min后，加入100mL无菌水，接种2.5mL菌液，在30℃下培养48h，取样稀释涂布计数[7]。液态发酵：取5g酱渣于115℃下灭菌20min后，加入100mL无菌水，接种2.5mL菌液，在30℃下，200r/min培养48h，取样稀释涂布计数。

1.2.5.2 碳氮源比例的确定 选择酱渣作为培养基的主要氮源，玉米粉作为主要碳源[8]，按酱渣∶玉米粉为9∶1、7∶3、1∶1、1∶2的比例进行配制，总质量为5g，于115℃下灭菌20min后，加入50mL无菌水，接种2.5mL菌液，在30℃下，200r/min培养48h，取样稀释涂布计数。

1.2.5.3 辅助元素添加种类的确定 取酱渣和玉米粉各2.5g作为基础培养基，然后分别添加0.1g MgSO4、K2HPO4、（NH4）2SO4、MnSO4、CaCO3、尿素[9-10]于115℃下灭菌20min后，加入50mL无菌水，接种2.5mL菌液，在30℃下，200r/min培养48h，取样稀释涂布计数。

1.2.5.4 辅助元素的优化 将筛选出的MgSO4、MnSO4、CaCO3三种辅助元素，在最适浓度左右浮动作为3个水平，选用3因素3水平正交表进行实验优化设计（如表1所示），采用正交软件助手对正交实验结果进行方差分析。

表1 正交优化实验因素和水平表Table 1 Factors and levels in orthogonal optimization experiment

2 结果与讨论

2.1 菌种分离筛选鉴定的结果

2.1.1 菌Tao1的表型特征及生理生化鉴定结果 Tao1为革兰氏阳性菌，其为白色菌落且菌落表面干燥，边缘呈毛发状，直径约2.5mm，经显微镜观察其为杆状，中生孢子；经一系列生理生化鉴定Tao1为地衣芽孢杆菌。

2.1.2 地衣芽孢杆菌Tao1的16S rDNA鉴定以及系统发育树的构建 地衣芽孢杆菌Tao1的16S rDNA为1320bp，将得到的16S rDNA序列提交到NCBI核酸数据库中进行BLAST在线分析，结果如表2所示。在前9个比对结果中，有7个结果显示为地衣芽孢杆菌，且同源性都为100%。通过构建系统发育树，结果如图1所示。结果表明，地衣芽孢杆菌Tao1与B.licheniformis（AY750906）以及B.licheniformis（EU257697）的遗传关系最近。综上所述分析可以得知Tao1菌种为地衣芽孢杆菌。

表2 GenBank中菌Tao1的前9个BLAST结果Table 2 The first nine results of BLAST of Tao1 in GenBank

2.2 菌Tao1的毒性及生长特性

2.2.1 菌Tao1的毒性 对灌服有Tao1的小白鼠进行观察结果表明，小白鼠的采食、饮水、粪便及行为表现均正常，无死亡动物出现。Tao1对小白鼠的LD50＞15000mg/kg，故Tao1应视为无任何毒性。该实验结果也表明，地衣芽孢杆菌Tao1能够像大多数益生地衣芽孢杆菌一样作为发酵菌种应用于发酵饲料。

2.2.2 菌Tao1的生长特性 通过对地衣芽孢杆菌生长温度，生长最适pH以及最佳转速的初步优化，确定其最适培养温度为30℃，最适pH为7.0，最佳转速为200r/min。在此条件下，测定菌种在LB液体培养基中的生长曲线，如图2所示，由此曲线可以看出，0～2h地衣芽孢杆菌处于延滞期，菌体数量较少。2～18h为对数生长期，菌体生长速率最大，18～28h为稳定期，菌体数量基本恒定。28h后，菌种进入衰亡期，菌数开始缓慢下降。因此，在24h左右即稳定期末期，该菌种的数量最多，菌种的生长活力最旺盛，可以用作扩培菌接种至发酵培养基中。该菌种的生长特性与江敏等筛选诱变的地衣芽孢杆菌D-11相比，对数生长期较长，最终到达稳定期时的OD值较大，表明该菌种具有更好的应用价值。

图1 菌Tao1的系统发育树Fig.1 The phylogenetic tree of Tao1

图2 地衣芽孢杆菌Tao1的生长曲线Fig.2 Growth curve of Bacillus licheniformis Tao1

2.3 培养基以及培养方式的优化

2.3.1 菌Tao1在固态培养基和液态培养基中的生长情况 由图3可以看出，地衣芽孢杆菌在未脱盐的液态培养基中生长最好，活菌数达到1.75×107cfu/mL。与固态液态培养方式对比来看，液态培养时菌种生长更好，这是由于液态培养时，培养基中的水分一方面提供了细菌生长所需的水分，另一方面它使酱渣培养基中的营养成分混合得更加均匀，更多更快地为细菌的生长提供营养。从三种处理方式不同的酱渣液态培养进行分析，可以看出，在未脱盐的酱渣中菌种生长的数量最多，这是由于酱渣脱盐处理的过程中会损失很多氨基酸、糖类等营养物质，这些营养物质能够促进菌体的生长。从三种处理方式不同的酱渣固态培养进行分析，可以看出，在脱一次盐的酱渣中活菌数最多，这是由于未脱盐酱渣用于固态发酵时，盐度太高所致。脱两次盐酱渣与脱一次盐的酱渣相比，其中的氨基酸、糖类等营养物质含量较少，故其中的活菌数比脱一次盐的少。综合以上分析，用未脱盐的酱渣进行液态发酵。

图3 菌Tao1在不同酱渣中液态和固态培养下的生长情况Fig.3 The growth of Tao1 in different soy sauce residue and different fermentation status

2.3.2 菌Tao1在加有玉米粉酱渣中的生长情况 如图4所示，地衣芽孢杆菌在酱渣∶玉米粉为1∶1时，活菌数显著高于其他比例时的活菌数（p＜0.05），达到1.25×109cfu/mL，随着玉米粉含量的增加，活菌数增加，当比例为1∶2时，活菌数有所下降，这是由于当玉米粉浓度大于一定数值时，它会抑制地衣芽孢杆菌的生长。综合以上分析，选择培养基中酱渣与玉米粉的比例为1∶1。

图4 地衣芽孢杆菌Tao1在不同酱渣与玉米粉比例下的生长情况Fig.4 The growth of Tao1 in different ratio of soy sauce residue and corn starch

图5 地衣芽孢杆菌Tao1在添加不同辅料的培养基中的生长情况Fig.5 The growth of Tao1 in adding different accessory factor

2.3.3 菌Tao1在加有其他辅料的培养基中的生长情况 如图5所示，在以酱渣和玉米粉为主的培养基中加入K2HPO4、MgSO4、（NH4）2SO4、MnSO4、CaCO3、尿素六种辅料，结果表明MgSO4、MnSO4、CaCO3三种辅料使活菌数增加，而K2HPO4、（NH4）2SO4、尿素三种辅料使活菌数降低。由图还可以看出CaCO3使活菌数增加最显著，MnSO4次之。而尿素和（NH4）2SO4使活菌数下降最明显，这是由于酱渣中含有很多氮源，再加入尿素或（NH4）2SO4后，使培养基中碳氮比例失调，进而造成活菌数的下降。因此选择MnSO4、MgSO4、CaCO3三种辅料。

表3 菌Tao1在复合培养基中的生长情况（正交实验优化）Table 3 The growth of Tao1 in compound medium（orthogonal design）

正交实验的结果如表3所示，三个因素极差的大小为MnSO4（B）＞CaCO3（C）＞MgSO4（A），且该实验的最优组合是A3B2C3，故地衣芽孢杆菌发酵培养基的最优配比是酱渣50g/L、玉米粉50g/L、MgSO43g/L、MnSO42g/L、CaCO33g/L。此时培养基中的活菌数可达6.55× 109cfu/mL。

该实验结果与现已报道的一些地衣芽孢杆菌（如谢银堂报道的地衣芽孢杆菌XY-2，谷春涛报道的地衣芽孢杆菌TS-01以及江敏报道的地衣芽孢杆菌D-11）相比，能获得更高的活菌数；并且与他们所用以豆粕作为培养基主要成分不同，该实验用酱渣作为发酵培养基的主要原料，具有更好的经济效益。

3 结论

实验从酱油渣中分离筛选出一株芽孢菌种，通过生理生化实验和16S rDNA分子鉴定其为地衣芽孢杆菌。毒性实验表明其无任何毒性，可以用作发酵饲料的菌种。对该菌种生长条件进行探索，确定30℃、200r/min、pH7.0为其最佳生长条件。对该菌种进行生长曲线测定，结果表明在24h时，能获得活力较好、数量最多的活菌体。

将该菌种以发酵酱油渣为饲料进行了研究，表明以液态培养的方式更有利于菌体的生长，酱渣与玉米粉的比例为1∶1时，发酵后的活菌数最多，以MgSO4、MnSO4、CaCO3为辅料时，有利于提高发酵后的活菌数，正交实验的结果表明当培养基组成为酱渣50g/L、玉米粉50g/L、MgSO43g/L、MnSO42g/L、CaCO33g/L时，培养基中的活菌数最多，可达6.55×109cfu/mL。

该实验结果与先前谷春涛、江敏等进行的地衣芽孢杆菌发酵饲料相比，菌种的活菌数有明显的提高，并且发酵的主要原料为廉价的容易造成环境污染的酱渣。该研究一方面减少酱渣对环境的污染，另一方面实现了变废为宝，生产出具有品质较好的饲料，实现了资源的合理利用，具有较好的经济效益。

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Isolation and identification of a Bacillus strain and its application in fermentation of soy sauce residue

WANG Hong-tao，LUO Li-xin*，ZHANG Shi-wei
（School of Bioscience＆Bioengineering，South China University of Technology，Guangzhou 510006，China）

One Bacillus strain was isolated from soy sauce residue，through physiological and biochemical experiments and the identification of 16S rDNA，the strain was identified as Bacillus licheniformis.The strain was used for fermenting soy sauce residue，the results showed that liquid state fermentation was better than solid state fermentation.When the soy sauce residue and corn starch residue ratio of 1∶1，the greater number of viable cells was obtained.Using orthogonal optimization for the added auxiliary elements，the results showed that under the condition of MgSO43g/L，MnSO42g/L，CaCO33g/L，the number of viable count in the culture medium reached the maximum number of 6.55×109cfu/mL.

soy sauce residue；Bacillus licheniformis；orthogonal experimental；liquid state fermentation

TS201.3

A

1002-0306（2012）07-0184-04

2011－07－07 *通讯联系人

王红涛（1987-），男，硕士研究生，研究方向：生物化工。基金项目：广东省农业攻关计划项目（2006B20501001）。