高产琥珀酸放线杆菌的诱变选育

林日辉，黄新林，黄文勤

（1.广西民族大学化学与生态工程学院，化学与生物转化过程新技术广西高校重点实验室，广西南宁530006；2.南宁奕德环境科技有限公司，广西南宁530003）

高产琥珀酸放线杆菌的诱变选育

林日辉1，黄新林1，黄文勤2

（1.广西民族大学化学与生态工程学院，化学与生物转化过程新技术广西高校重点实验室，广西南宁530006；2.南宁奕德环境科技有限公司，广西南宁530003）

对琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes mdrh-5）进行紫外-亚硝基胍复合诱变，采用变色圈、氟乙酸耐受和CuSO4快速分析结合的筛选方法，获得1株高产琥珀酸突变菌株。与野生菌相比，突变株琥珀酸产量提高了43%，副产物乙酸降低了66%，突变株遗传性质稳定。

琥珀酸，发酵，紫外-亚硝基胍复合诱变

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

琥珀酸放线杆菌（A.succinogenes mdrh-5） 本实验室从牛的瘤胃中分离保存；琥珀酸 sigma公司；亚硝基胍 北京中胜华腾科技有限公司；酵母提取物 广东环凯微生物科技有限公司；胰蛋白胨 OXOID公司；氟乙酸钠 本实验室制备；其他试剂 均为国产分析纯。

LC-20A高效液相色谱仪 日本岛津公司；Aminex HPX-87H色谱柱 美国伯乐公司；F254硅胶板 德国Merck公司；THZ-C恒温摇床，磁力搅拌器等。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基的制备

1.2.1.1 菌种传代保藏培养基（1L） 酵母提取物3.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，琼脂20.0g，pH7.0~7.2。

1.2.1.2 平板分离培养基（1L） 酵母提取物5.0g，蛋白胨5.0g，葡萄糖20.0g，氯化钠5.0g，琼脂20.0g，溴甲酚氯0.1g，pH7.0~7.4，添加适宜浓度氟乙酸钠。

1.2.1.3 种子培养基（1L） 胰蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，氯化钠10.0g，pH7.0~7.2。

1.2.1.4 发酵培养基（1L） 葡萄糖20.0g，酵母提取物5.0g，磷酸氢二钾1.0g，氯化钠0.5g，硫酸铵1.0g，二水氯化钙0.5g，六水氯化镁0.5g，碱式碳酸镁1.3g，pH7.0~7.2。

1.2.2 诱变及选育

1.2.2.1 野生菌株生长曲线的绘制 将野生菌株按1%接种量接种于五瓶同一时期配制的种子培养基中，于37℃、150r/min条件培养30h，每隔2h取样，测定OD600，绘制菌株生长曲线。

1.2.2.2 菌悬液的制备 用接菌环挑取少量斜面种子接种于50mL/250mL种子培养基中，37℃水浴摇床培养10~12h，使菌体处于对数生长期，无菌操作下离心收获菌体，用0.9%的生理盐水洗涤两次，并制备菌悬液，使细胞个数在107cfu/mL。

1.2.2.3 紫外诱变致死率的测定 取上述菌悬液10mL移入灭菌培养皿中，磁力搅拌50r/min，在20W紫外灯下20cm分别照射0、15、25、45、65、90s，取样1mL适当稀释，涂布于LB平板，37℃避光厌氧培养48h计菌落数，计算致死率。

1.2.2.4 NTG诱变致死率的测定 取预处理菌悬液5mL，添加NTG至0.3mg/mL，150r/min振荡处理0、20、40、60、80min，分别取0.5mL菌悬液，用0.16mol/L硫代硫酸钠溶液稀释10倍，终止诱变反应，离心收集细菌细胞，用生理盐水洗涤后制备菌悬液，适当稀释，涂布于LB平板，37℃厌氧培养48h计菌落数，计算致死率。

1.2.2.5 野生菌株氟乙酸钠抑制浓度的确定 在分离平板上添加氟乙酸钠浓度分别为0、0.3、0.7、1.0、1.5g/L，取0.5mL浓度约为103cfu/mL的野生菌悬液涂布平板，观察平板上菌落生长情况，确定氟乙酸钠对A.succinogenes mdrh-5的抑制浓度。

1.2.2.6 复合诱变 无菌取107cfu/mL的菌悬液10mL于灭菌平皿中，用紫外线照射25s。红光灯下，取照射后菌液5mL加入NTG处理40min后，用硫代硫酸钠中止反应，洗涤并收集菌体细胞，制备菌悬液，稀释涂布于分离平板，遮光37℃厌氧培养48h，挑取菌落较大，变色圈直径大于5mm单菌落。

1.2.2.7 摇瓶发酵培养 12h种龄的种子，按5%的接种量接种于发酵培养基。通入CO2至饱和，胶塞密封，在37℃、150r/min培养20h。发酵液于12000r/min下离心5min，上清于-20℃保存待测。

1.2.3 发酵液成分分析

1.2.3.1 CuSO4甲醇溶液显色分析 取5μL上清液，直接点样至干燥的硅胶板上，吹干，用15g/L的CuSO4甲醇溶液均匀喷洒，干燥显色。

1.2.3.2 HPLC定量分析 使用岛津LC-20A系统，色谱柱为Aminex HPX-87H柱，柱温65℃，流动相为0.005mol/L H2SO4，流速为0.6mL/min；检测器为CTO-10vp型折光示差检测器。发酵上清液经过0.45μm滤膜过滤，适当稀释后进样，进样量20μL。

1.2.4 突变株稳定性测定 将筛选出的诱变菌株在固定培养基上连续培养传8代，每代均在相同条件下发酵，测定其琥珀酸产量，考察菌种的遗传稳定性。

2 结果与分析

2.1 A.succinogenes mdrh-5生长曲线

图1表明，以种子培养基进行批式培养，A. succinogenes mdrh-5生长对数期约在2~12h，其中8~ 12h为对数生长期的中后期，此时，细胞代谢活力旺盛，并且对各种异常的条件包括诱变因素比较敏感。因此，本研究选用培养8~12h的A.succinogenes mdrh-5菌株进行诱变。

图1 野生菌A.succinogenes mdrh-5生长曲线Fig.1 Growth curve of A.succinogenes mdrh-5

2.2 紫外诱变的致死率

紫外线作为物理诱变因子，能使DNA分子形成嘧啶二聚体，减弱双键间氢键的作用，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，导致突变或死亡。由图2的紫外致死曲线可以看出，在0~25s内致死率随照射时间延长迅速提高，其中25s照射时间致死率为76.5%，45s后致死曲线趋于平缓并接近100%。有报道介绍70%~80%致死率有利于正突变的产生[9]，故实验采用紫外线照射时间为25s。

图2 紫外线诱变的致死率Fig.2 Mortality rates of ultraviolet mutation

2.3 NTG诱变的致死率

图3 NTG诱变的致死率Fig.3 Mortality rates of NTG mutation

NTG是应用广泛的化学诱变剂之一，细胞经NTG处理，可诱发GC-AT的转换，另外还可诱发DNA小范围切除、移码突变及GC对缺失的突变发生。0.3mg/mL的NTG诱变致死率如图3所示，可见，致死率随处理时间延长而增加，80min致死率接近100%。处理时间为40min的致死率为88.3%，实验选择40min作为NTG诱变处理时间。

2.4 氟乙酸浓度的选择

A.succinogenes mdrh-5副产物中杂酸含量较大（表2），其中，乙酸占副产物总量的31.4%，降低发酵产乙酸可以大幅降低副产物含量。氟乙酸为乙酸类似物，经磷酸转乙酰基酶-乙酸激酶途径转化为氟代柠檬酸，阻断正常的三羧酸循环，导致细菌细胞死亡[10]。筛选氟乙酸抗性菌株则有可能阻断磷酸转乙酰基酶-乙酸激酶途径，降低发酵过程副产物乙酸的产量，促进代谢碳流流向主产物琥珀酸。表1表明，氟乙酸钠在0~1.0g/L时，对A.succinogenes mdrh-5抑制率随氟乙酸钠浓度提高而提高，1.5g/L氟乙酸钠的抑制率达100%。本实验选择1.5g/L氟乙酸钠作为抗性突变株的筛选浓度。

表1 氟乙酸的抑制浓度Table 1 Inhibit concentration of fluoroacetic acid

2.5 琥珀酸高产菌株的筛选

2.5.1 分离平板初筛 经紫外、NTG复合诱变的菌悬液稀释涂布于含1.5g/L氟乙酸分离平板进行初筛（图4），获得463个氟乙酸抗性单菌落。根据变色圈大小从中挑取60株产酸量较大的菌株（变色圈大于5mm）。

图4 分离平板的初筛结果Fig.4 Preliminary screening result of plate separation

2.5.2 发酵液检测分析

2.5.2.1 CuSO4显色分析 H.Socˇicˇ[11]等报道了薄层层析后使用CuSO4显色对发酵产琥珀酸进行定性分析，然而TLC展开操作耗时较长、操作繁杂。本实验探索了直接用CuSO4显色半定量分析发酵液琥珀酸的方法。结果表明：在1~10g/L浓度范围内，琥珀酸浓度与色斑深浅正相关；甲酸、乙酸、乳酸等发酵副产物均不能与CuSO4显色。部分初筛菌株发酵液CuSO4显色检测结果见表2。根据5g/L标准琥珀酸色斑深浅，迅速在60株产酸菌种检出了8株疑似琥珀酸高产突变菌。

2.5.2.2 HPLC分析 由于CuSO4显色法主要用于对发酵液中琥珀酸定性分析，为了验证CuSO4分析结果，将所挑取的8株疑似琥珀酸高产突变株进行重新发酵，并采用HPLC对发酵液进行了定量分析。HPLC分离结果见图5。可见，HPLC可以有效分离发酵液中的底物、琥珀酸及各种副产物，应用外标法即可精确计算各菌株发酵液中产物及副产物含量，结果见表3。

图5 M4发酵液HPLC图Fig.5 HPLC of the strain M4’s fermentation broth

表2 突变菌株发酵液的CuSO4显色检测结果Table 2 CuSO4analysis result of the mutants’fermentation broth

表3结果表明，根据CuSO4显色半定量分析法挑取的疑似琥珀酸高产菌中，87.5%菌株琥珀酸产量高于野生菌，说明本实验设计的CuSO4检测分析方法可以快速有效地从大量突变菌中鉴定出琥珀酸高产菌。其中，编号M4突变株的琥珀酸产量最高，达到7.87g/L，比野生型提高43%；主要副产物乙酸的积累比野生菌株降低66%；副产物乳酸、甲酸及乙醇的积累分别降低21%、20%和43%。

2.6 突变株的稳定性

由表4可知，突变株M4各世代琥珀酸产量基本稳定，可见经复合诱变后，菌株的基因发生了突变，有较好的遗传稳定性，该菌株可作为后续发酵优化及代谢调控研究的菌株。

表3 野生菌株mdrh-5及部分突变株的发酵结果Table 3 Fermentation results of A.succinogenes mdrh-5 and the mutants

表4 突变株M4传代稳定性Table 4 Heredity stability of the mutant M4

3 结论

本研究通过紫外-NTG对A.succinogenes mdrh-5进行复合诱变处理，利用溴甲酚绿-氟乙酸平板初筛、发酵液CuSO4显色快速分析以及HPLC复检的高效筛选方法，迅速选育出一株有潜力的琥珀酸发酵突变菌。20g/L初糖浓度摇瓶发酵结果，琥珀酸产量为7.87g/L，比原始菌株提高了43%，副产物乙酸积累比野生菌株降低了66%。经过传代实验，该菌遗传性能稳定，可为后续发酵优化及代谢调控研究提供基础。

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Mutation and screening for high yield Actinobacillus succinogenes

LIN Ri-hui1，HUANG Xin-lin1，HUANG Wen-qin2
（1.Key Laboratory of New Techniques for Chemical and Biological Conversion Process，College of Chemistry and Ecological Engineering，Guangxi University for Nationalities，Nanning 530006，China；2.Nanning YiDe Environment Technology Limited Cooperation，Nanning 530003，China）

The Actinobacillus succinogenes mdrh-5 was treated with ultraviolet and nitrosoguanidine.A mutant was isolated based on an efficient screening method combining color-changing circle，monofluoroacetate tolerance with CuSO4fast analysis.Compared with the wild type strain，the mutant’s succinic acid production increased 43%，together with 66%decrease of acetic acid production，and the mutant’s heritability was stable. Key words：succinic acid；fermentation；ultraviolet-nitrosoguanidine mutagenesis

TS201.3

A

1002-0306（2012）07-0161-04

琥珀酸（succinic acid），又称丁二酸，既是三羧酸循环（TCA）的中间产物，也是一些厌氧微生物代谢的发酵产物之一[1]。琥珀酸作为化工原材料，广泛使用于食品、医疗药品、清洁剂、生物可降解塑料、表面活性剂等应用领域[2]。目前琥珀酸的生产主要通过石蜡氧化法、反丁烯二酸加氢法、氯乙酸甲酯水解法等化学方法合成[3]，但传统的化学合成法不但成本高，而且易造成环境污染等问题。利用微生物发酵生产琥珀酸具有成本较低、环境友好、原料可再生的优势；此外，发酵法生产琥珀酸是一种消耗和利用二氧化碳的工艺过程（理论上每发酵生产1t琥珀酸可固定0.37t CO2），这对于缓解大气中的温室效应有着积极的意义。目前，利用微生物发酵法生产琥珀酸逐渐成为生物化工领域的研究热点。随着微生物学、分子生物学的发展，利用代谢工程、基因工程等手段定向育种的方法也广泛应用于琥珀酸生产菌的选育[4-6]，并取得良好的效果，但仍存在缺乏针对性的工具质粒、或突变株遗传稳定性差等问题，目前这些方法成功应用于生产的例子还很少。诱变育种操作简单，突变株遗传稳定性好，结合高效筛选方法，仍是一种有效的菌种选育手段[7-8]。研究以本实验室分离获得的琥珀酸放线杆菌（A.succinogenes mdrh-5）作为原始菌株，利用紫外及亚硝基胍（NTG）进行复合诱变处理，结合高效筛选及分析方法，获得1株琥珀酸高产突变株。

2011－06－20

林日辉（1972-），男，副教授，博士，主要从事发酵工程，酶工程方面的研究。

国家民委科研项目（10GX07）；广西教育厅科研项目（201012MS072）；广西民族大学重点项目科研基金（200701YJ01）。